4．1．3 分离
（1）编号
取五支无菌水试管，分别用记号笔标明10-1、10-2……10-5。
（2）稀释
在无氧无菌的超净厌氧手套箱中的条件下，用无菌注射器吸取1mL混合均匀的液体样品，加入装有预还原生理盐水的厌氧试管中，用震荡器将其混合均匀，制成10-1稀释液。用无菌注射器吸取1mL10-1稀释液至另一装有9mL生理盐水的厌氧试管中，制成10-2稀释液。依此进行10倍系列稀释，至10-6，制成不同样品稀释液。通常选10-4、10-5、10-6三个稀释度进行滚管计数。
（3）滚管分离
1）滚管
将无氧无菌的琼脂培养基在沸水浴中溶化，置46-50℃恒温的水浴中，待用，当培养基从瓶中取出时，要用N2在培养基内中充气。再在试管中用N2充气，赶走所有管内空气，然后把培养基加入管内，立即塞上瓶塞。待瓶塞塞入管内，及时拔出充气针头。用无菌注射器吸取10-4、10-5、10-6三个稀释度各0
.1mL，分别注入待用的试管中，然后将其平放于盛有冰水的瓷盘中迅速滚动，带菌的溶化琼脂在试管内壁会即刻形成凝固层。
2）分离纯化
生成的菌落需挑取出来，镜检其形态及纯度。如尚未获得纯培养物，需再次稀释滚管，并再次挑取菌落，直至获得纯培养物为止。待挑取的单菌落预先在放大镜下观察确定，做好标记。然后将培养基试管固定于适当的支架上，打开试管胶塞，同时迅速将气流适当、火焰灭过菌的氮气长针头插入管内。同时，另一液体厌氧管去掉胶塞插入另一灭过菌的通气针头。将准备好的弯头毛细管小心插入固体培养基内，找准待挑菌落，轻轻吸取，转移至液体试管内，加塞。37℃培养，培养24h或更长时间或待培养液混浊后检查已分离培养物的纯度。
3）划线分离
将试管橡皮塞的一端在火焰上灼烧一下，挨着打气针塞住管口，在针头快速取下前，通气15-20s，管口一端在火焰上烧片刻。旋紧管塞，划线后的卷管直立保温，使用CO2:H2=80:20,因为CO2比空气重，开启后管塞不致有空气残留。划线后的滚管，置34-37度下培养，便可长出菌落。
4．1．4 镜检与计数
（1）镜检
挑取特征性菌落制片，革兰氏染色后镜检，观察菌体形态。
（2）计数
液体纯培养物经系列稀释后，按上述滚管法培养。然后对固体滚管计数，计算每克或每毫升样品中含有厌氧菌数量cfu/g（mL）样品=A×10ml×X/10×D
A-0.1mL滚管计数的实际平均值；
X- 镜检呈现为厌氧菌的数目；
X/10-菌落中厌氧菌的概率；
D- 稀释倍数
4．2 菌种的鉴定
4．2．1糖发酵试验
糖发酵实验是最常用的生化反应，在肠道细菌鉴定上尤为重要。绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源，但是它们在分解糖的能力上有很大差异，有些细菌能分解糖并产酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和气体（如氢、甲烷、二氧化碳等）；有些细菌只产酸不产气。例如大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气；伤寒杆菌能分解葡萄糖产酸不产气，不能分解乳糖；普通变形杆菌分解葡萄糖产酸产气，不能分解乳糖。酸的产生可以利用指示剂来断定。在配制培养基时预先加入溴甲酚紫[pH5.2(黄色)—6.8（紫色）]，当发酵产酸时，可使培养基由紫色变为黄色。气体的产生可由发酵管中倒置的德汉氏小管中有无气泡来证明。
具体实验步骤：
① 将菌液进行适当稀释，之后在无菌环境下，取一定量的稀释液注入生化鉴定管中，用无菌封口膜封口。
② 将接种后的鉴定管放入厌氧罐中，充足氮气后放入37℃恒温培养箱培养。
③ 24h后观察各管中液体颜色变化及产气情况。
4．2．2 蛋白质分解实验
① 将菌液进行适当稀释，之后在无菌环境下，取一定量的稀释液注入生化鉴定管中，用无菌封口膜封口。
② 将接种后的鉴定管放入厌氧罐中，充足氮气后放入37℃恒温培养箱培养。
③24h后各管分别进行米伦氏反应、吲哚反应、黄色反应和坂口反应等。
4．2．3 淀粉水解实验
① 将菌液进行适当稀释，之后在无菌环境下，取一定量的稀释液注入生化鉴定管中，用无菌封口膜封口。
② 将接种后的鉴定管放入厌氧罐中，充足氮气后放入37℃恒温培养箱培养。
③ 24h后于各管中加入适量卢戈氏碘液观察淀粉的水解情况。
五 注意事项及注释：
1 注射器在使用前必须经过121℃、20min灭菌。
2 注意无菌操作，保持手和培养管的清洁。每次接种前需用酒精棉球将厌氧管盖子擦一遍。
3 用注射器吸取菌悬液注入固体培养基后，如需再次吸取，应快速将注射器插入厌氧管中，以防止针头污染。
4树脂刃天青（resazurin）既是还原剂又是指示剂，它可以把培养基中残留的溶解氧去除，其氧化还原电位指示敏感范围为-42mV。有氧时呈紫色或粉红色，无氧时呈无色（培养基的颜色），它是较为理想的氧化还原电位指示剂和培养严格厌氧菌不可缺少的。
5培养基中加入的青霉素是用来抑制其它细菌生长的，因为厌氧菌的细胞壁成分为假肽聚糖，不受青霉素影响。
6注射器在使用前必须先用培养基上面的气体冲洗、填充，然后插入培养基的下层，以保证当培养基移入试管时，就处于无氧气体层的下面。
首页
