试剂、试剂盒 退火缓冲液B&W(结合洗脱）缓冲液dNTP溶液甲酰胺染液羟胺KMnO4 TEAC嘧啶Taq DNA聚合酶Taq DNA聚合酶缓冲液待测和对照基因组DNA
仪器、耗材 磁力架微孔滴定板或微管振荡器链霉抗生物素蛋白包被的磁珠热循环仪
实验步骤
一、材料
1. 缓冲液、溶液和试剂
（1）退火缓冲液，2X: 1.2mol/LNaCl12 mmol/LTris-HCl、pH7.5 和 14 mmol/LMgCl2。高压灭菌，室温保存。
（2）B&W(结合洗脱）缓冲液：10mmol/LTris-HCl、pH7.5，1mmol/LEDTA和2.0mol/LNaCl。高压灭菌，室温保存。
（3）dNTP溶液（含4种dNTP，每种10 mmol/L)。
（4）甲酰胺染液：0.2 ml右旋糖酐（50 mg/ml) 加0.8ml甲酰胺配成1ml染液，每份样品用 1.5ul染液。
（5）羟胺。在通风橱中按如下步骤准备羟胺溶液。
在玻璃管中用 1.6 ml水溶解1.39 g固体羟胺，热水中轻摇。逐滴加入lml二乙胺, 缓慢加入750ul羟胺调节pH到6左右。为准确測定pH, 加 2滴羟胺溶液到2 ml水中。注意不要直接将电极放到未稀释的羟胺溶液中。溶液在4°C可保存7?10天，一20°C可储存6个月。
（6）KMnO4/TEAC，在3mol/LTEAC(氯化四乙铵）中溶解100 mmol/LKMnO4
(方法A中选用）。
（7）哌啶，10%。
2. 酶和酶缓冲液
Taq DNA聚合酶
Taq DNA聚合酶缓冲液，10X(与酶一起提供）
3. 核酸和寡核苷酸
待测和对照基因组DNA
4. 特殊设备
与筛选管或微孔滴定板系统相配套的磁力架
聚乙烯或聚丙稀材料的微孔滴定板或微管（如AdvancedTechnologies或Nunc)
聚碳酸酯不能耐受碾啶。
振荡器，室温下使用
链霉抗生物素蛋白包被的磁珠（DynabeadsM-280Norway)
热循环仪
二、方法A: 放射标记反应
以下是制备放射性标记探针的方案。用p53肿瘤抑制基因中的5号外显子作为靶DNA。
扩增待测 DNA使用同样的步骤（不含[a-32P]dCTP)。
(一）附加材料
1. 缓冲液、溶液和试剂
甲酰胺染液
H3PO4(1mol/L)
四氧化锇*(Sigma-Aldrich)缓冲液，按下面配备。
100 mmol/LTris-HCl、pH7.7，10mmol/LEDTA,15% 嘧啶。通风橱中，先在玻璃瓶中加入12.5 ml灭菌双蒸水（ddH20), 然后打碎一管0.5 g的四氧化锇，再将瓶子放到带有鏢丝旋盖的容器中，确保盖子紧闭。四氧化锇在塑料中不活泼。缠绕铝箔后在4°C下溶解2~3天，4°C储存。使用前用ddH20按1:5稀释即可。四氧化锇溶液可在-20°C储存6个月。当与嘧啶反应时出现黄色说明反应成功，若储存液(通常2个月后）呈现绿色或灰色，则应重新配制。
四氧化锇溶液（在H20中1:5)
2. 核酸和寡核苷酸
5A: 5‘-TTCAACTCTGTCTCCTTCCTCTTCC-3’
5B：5‘-CTGGGGACCCTGGGCAACC-3’
在一套引物中，正义引物用生物素标记；另一套引物中，反义引物用生物素标记。
3. 放射性混合物
[a-32P]dCTP(50uCi)(1Ci=3.7X1010Bq)
4. 特殊设备
Geiger计数器
温育或水浴，预置 37°C、42°C、90°C
磁力架，预冷
5. 附加物品
常用聚丙烯酰胺凝胶电泳设备及试剂（测序胶）
琼脂糖凝胶电泳设备及试剂，溴化乙锭
Qiaquickspincolumns或类似设备，用来从球脂糖凝胶中纯化DNA
四氧化锇可用溶有100 mml/L高锰酸钾（KMn04)的3mol/LTEAC(氯化四乙铵）溶液替换。高锰
酸钾溶液应现配现用。3mol/L的TEAC在-4°C下可储存3个月。
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