实验室分析方法--气相色谱固相萃取技术介绍

固相萃取法（Solid-phase Extraction，SPE）是一种较新的、发展很快的样品预处理方法。在本章介绍的所有样品预处理方法中，SPE也许是当前应用最为广泛的方法之22它是以液相色谱的分离机理为原理的抽提分离浓缩技术，采用高效、高选择性液相色谱固定相，利用样品组分在固定相和洗脱相之间的分配平衡实现目标组分和样品基质的有效分离。和传统溶剂萃取法相比，固相萃取法能显著减少溶剂用量和降低样品处理成本；一般来说，所需费用仅为液相萃取的1/5。

一、固相萃取法
固相萃取的操作原理是将液态或溶解后的固态样品倒入活化过的SPE柱，然后利用抽空或加压使样品进入SPE柱的固定相。利用固定相和样品组分间的相互作用实现对目标组分的富集和对样品基质的去除。为提高处理效率，可以采用SPE歧管真空装置同时处理多个样品。一般地，SPE在分离步骤中保留感兴趣的组分和类似的其他组分，并尽量减少不需要测定的样品组分的保留。弱保留的样品组分可用一种溶剂冲洗掉，然后用另一较强溶剂把感兴趣的分析物从固定相上洗脱下来。有时根据样品和固定相作用强度不同，也可以让感兴趣的组分（分析物）直接通过固定相而不被保留，同时将大部分干扰物保留在固定相上，从而实现分离净化的目的。但在多数情况下，使分析物得到保留更有利于样品的净化。

SPE小柱是进行SPE处理的核心部件。一个SPE小柱由三部分组成：柱管、烧结垫、固定相，柱管一般做成注射器形状，多由血清级的聚丙烯制成，一些厂家也提供玻璃柱管。柱管下端有一突出的头，此头的尺寸已标准化，可用于各种不同的SPE歧管真空装置。烧结垫除了能固定固定相外，也能起一些过滤作用。聚乙烯是常见的烧结垫材料，对于特殊样品也可使用特氟隆或不锈钢片。固定相是SPE柱中最重要的部分最常见的SPE固定相是键合的硅胶材料，采用不规则形状、孔径60A（1A＝0.1nm，下同）、粒径40μm的硅胶粒作为原材料，然后用各种硅烷将官能团键合上。此外也有一些非硅胶基的固定相可供选用。

固定相的色谱特性决定了可被保留的组分和保留的强度，固定相的选择是发展SPE方法的最重要因素，它不仅取决于目标分析物质和样品基质，也受样品溶剂影响。

选择最佳固定相时，须考虑以下几点：

（1）目标组分在极性或非极性溶剂中的溶解度；

（2）目标组分有无可能离子化，从而决定可否使用离子交换固定相；

（3）目标组分有无可能与固定相形成共价键；

（4）杂质组分与目标组分在固定相结合点上的竞争程度。

分析物的极性与固定相极性非常相似时，可使目标组分得到最佳保留。两者极性越相似，保留越好。所以要尽量选择极性相似的固定相。例如，萃取碳氢化合物（非极性）时要采用反相柱（非极性）。而当分析物极性适中时，正、反相固定相都可使用。

固定相选择还受样品溶剂制约。样品溶剂强度相对固定相应该较弱。弱溶剂会增强分析物在固定相上的保留。如果溶剂太强，目标组分将得不到保留或保留很弱。举例来说，样品溶剂是正己烷时，用反相柱就不合适，因为正己烷是强溶剂，分析物无法在柱上保留；当样品溶剂是水时，就可以用反相柱，因为水是弱溶剂，不影响分析物的保留。

表1列出了目前常用的SPE固定相及其保留机理，以供参考。每根SPE小柱的固定相质量一般为100mg、200mg、500mg或1000mg。为保证满意的样品净化效果和充分的保留，处理脏的、复杂的或高浓度的样品时应采用固定相质量较大的小柱。

表1  常用的SPE固定相极其保留机理

而对于体积较大的液相样品，如水样分析，还可用储样器，连接在柱管上方以增加sPE容积，能在很大程度上提高一次上样量（可达75～100mL）。

SPE方法一般有四个基本操作步骤:固定相活化、样品上柱、淋洗和分析物洗脱。活化的目的是创造一个与样品溶剂相容的环境并除去柱内所有杂质。上样步骤指的是样品加入到SPE柱并迫使样品溶剂通过固定相的过程这时分析物和一些样品干扰物保留在固定相上。

为了保留分析物，溶解样品的溶剂必须较弱。分析物得到保留后，通常需要淋洗固定相以洗掉不需要的样品组分。淋洗溶剂总是略强于或等于上样溶剂。淋洗溶剂必须尽量地强以洗掉尽量多的不需要的组分，但不能强到可以洗脱任何一个分析物的程度。淋洗过后，将分析物从固定相上洗脱。洗脱溶剂用量一般是0.5～0.8mL/100mg固定相。这时必须认真选择溶剂：溶剂太强，一些更强保留的不必要组分将被洗出来；溶剂太弱，就需要更多的洗脱液来洗出分析物，SPE柱的浓缩功效就被削弱了。表2中列举了SPE方法中常用的溶剂以及它们的洗脱强度，以供参考。收集起来的洗脱液可以直接向色谱柱进样，也可以把它浓缩后溶于另一溶剂中来进样或以其他方式进行进一步净化。

表2溶剂强度列表

因为方法步骤较多，且影响萃取结果的因素也较多，发展一个成熟的SPE方法必须进行参数优化。优化过程中必须考虑的因素包括固定相的选择，洗脱溶剂的选择，柱容量，以及洗脱流速等。一个好的SPE方法能对特定的复杂基质中多个目标组分同时实现可靠的定量回收并有一定的稳健性，适合在不同实验室间进行推广。

经过十几年的快速发展，SPE方法的商品化程度相对较高，有多种适用于不同样品基质不同目标组分的SPE小柱以供选择，且价格较低。虽然SPE小柱不能反复使用，总体来说，样品预处理方法的成本仍可以接受。对于典型应用领域，已经发展出一些标准化方法，省却了用户自行发展SPE方法的步骤。一些应用实例请见参考文献。读者也可根据具体需求查阅文献、技术说明和应用报告，获取更多方法细节。

二、基质固相分散萃取法

基质固相分散萃取法（Matrix Solid-phase Dispersion，MSPD）主要用于固体和半固体样品的处理，也有用于液体样品处理的实例。这是一种在SPE基础上改进所得的预处理方法，但操作更加简化。和SPE方法的相同之处在于，它也利用固相萃取材料对样品基质或基质中待测组分的选择性进行分离净化。不同之处在于，根据样品基质、待测组分和所选用固相萃取材料的特点，有时无需装柱洗脱，只要过滤浓缩即可实现目标组分和样品基质的分离。操作简便之余，对于某些种类的分析物同样具有很好的提取效率。

应用于固体或半固体样品时，通常会将样品组织匀浆、萃取、净化等过程整合在一步完成，在均质化的样品基质中加入固相草取材料混合成为半湿状态的混合物，这样可以有效避免多步操作造成的样品损失，也是MSPD方法的一大优点。提取步骤完成后，如果主要干扰物被固相萃取材料吸附而目标组分仍在液体基质之中，则无需装柱，可以加入适当溶剂进一步提取目标组分，再经过滤去除固体材料完成样品预处理。但多数时候，半湿的固体萃取材料吸附目标组分，得到的混合物装柱后采用类似SPE的方法淋洗洗脱出待测组分，而后上样分析。这种样品预处理方法价格低廉，所需样晶体积小，溶剂使用量少，成本低，对人员操作技术要求不高，更适合方法的应用推广。

不难理解，影响提取效率的主要因素是固相萃取材料的选择，目前C18填料最为常见，也可采用中性氧化铝等材料。此外，和SPE方法一样，洗脱液的种类和流速也是影响提取效率的重要因素，需在方法发展阶段系统优化。

三、 QuEChERS法

 QuEChERS 意指Quick，Easy，Cheap，  Effective， Rugged and Safe，即能满足“快速高效，容易操作，价格低廉，适用面广，而且安全”等要求的样品预处理技术。这本应是普遍适用于任何样品预处理方法的策略或要求，但当下已经成为专有名词，意指一种用于蔬菜、水果等含水量大的食品中多种农药残留物定量和定性分析的样品预处理技术。相对于其他样品预处理手段，这种技术面世时间较短（发明于2003年），但已在食品农残分析领域获得了极为广泛的应用，其主要原因有二。其一，方法操作简单，易于实施；既不需要特殊仪器，也不需要经验丰富的实验人员进行大量实验参数的优化。虽然方法仍以人工操作为主，尚未实现自动化，但在绝大多数情况下，只需几步操作，就可以实现多种样品基质中数百种化合物定性、定量分析的预处理，完成气相色谱或液相色谱上样前的准备工作。其二，该法普适性非常强，可以用于任何含水量高的食品样品基质中的偏极性农药残留物，针对同一个样品基质又能同时提取数百种农药残留，回收率和重现性均令人满意。加之同传统方法相比，能节约90％以上的溶剂、耗材成本和样品处理时间，特别适用于食品安全实验室等检测机构进行大批量样品农残筛查常规分析。有鉴于此，目前已开发出数个关于 QuEChERS样品预处理方法的标准方法，如AOAC方法2007.01和欧盟标准方法EN15662等，亦有多家公司推出不同规格的商品化 QuEChERS试剂盒，用户可根据具体选用的 QuEChERS方法（如早期方法、AOAC方法或EN方法），待测化合物组成，样品基质类型（是否含有油脂、蜡，或色素），和样品体积，来选择适当的缓冲盐和分散固相萃取剂，以达到有效的样品预处理结果。

 QuEChERS方法其实是结合了液-液萃取和分散式固相萃取两种方式来实现对基质中目标化合物的提取和分离的，其典型操作步骤如下：

①样品粉碎均质化。此步对于采集有代表性的样品、提高萃取效率和增加分析精度都非常重要。

②定量称取样品（通常为10～15g），加入乙腈，加入内标，剧烈振摇萃取30s到1min。如有必要，还需加入无水缓冲盐来调节基质pH值，以提高样品回收率和降低基质干扰，常用的无水缓冲盐包括无水硫酸镁、氯化钠、乙酸钠、柠檬酸钠和柠檬酸氢二钠或它们的组合，每份样品中通常添加数克。

③在萃取液中加入固体微粒吸附剂（分散固相萃取剂），用以除去乙腈萃取液中的共萃物。最为常见的萃取剂是乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）和C18，亦可添加石墨化炭黑用于去除色素和甾醇。此外，还可加入少量无水硫酸镁进一步去除残留水分。

在商品化 QuEChERS试剂盒中，缓冲盐和固体微粒吸附剂已事先定量密封在无水包装中，使用起来非常方便。如不使用商品化试剂盒也可根据实验室的条件和样品性质，用SPE方法代替分散固相萃取法进行此步处理，但相应的，会增加预处理的耗材和时间成本。

④过滤样品，上样分析。

需要注意，虽然 QuEChERS方法本身并不需要或要求过度细致地优化实验参数，但如果目标化合物的种类较少或性质比较单一，也可以考虑根据实际情况对预处理方法进行微调，以实现更好的处理结果。最常影响提取效果的因素包括提取液的pH值、缓冲容量及分散固相萃取剂的种类。例如，沙蚕毒素类农药需在较低pH值条件下进行提取；对于富含油脂的样品，可以考虑提高PSA的用量或加入少量C18；而石墨化炭黑不能用于平面结构的农药测定等。此外，正是因为 QuEChERS方法对很多偏极性化合物都有较好的提取效果，经过此法处理的样品相对来说可能较“脏”，会含有较多非目标化合物组分，上样分析时最好考虑选择性较高的检测器，对气相色谱来说，除了质谱或串联质谱以外，FPD、NPD、ELCD、ECD、XSD等检测器都可选用。

经过十几年的发展，QuEChERS方法热度不减。近年来的主要发展方向包括：

①方法统一化。国际官方方法认证机构希望能开发通用的 QuEChERS方法，将同一方法（包括固定的操作条件和实验参数）应用于更多种类样品的分析中，作为国标方法或是国际统一认证的方法。

②更为广泛的应用范围，包括更多种类的样品基质，如血浆、肉类、酒和土壤样品等更多的待测物类别，如抗生素、药物、滥用药、污染物等；以及更多的应用领域，如环境检测、医学、法医检测等。必须根据样品基质的性质和基质与目标化合物之间结合力的强度对 QuEChERS方法进行改进和充分验证，以正确评估方法的有效性。

③方法的自动化，目前典型的 QuEChERS方法还是以手动操作为主，但如需进一步增加样品分析的通量，或是提高某些和基质结合力更强样品的提取率，可能需要考虑发展自动化振摇装置来代替手动提取。