试剂、试剂盒 双蒸水RT-PCR 缓冲液MMLV 逆转录酶SUPERaseINRNA 酶抑制剂 Taq DNA 聚合酶总 RNA 随机引物dNTP 混合物 基因特异的正向引物基因特异的反向引物[a-32P]dCTP
仪器、耗材 Quantu mRNA Universal 18S standards PCR 管 PCR 仪
实验步骤
一、材料
1. 缓冲液、溶液和试剂
去除 RNA 酶的双蒸水
10XRT-PCR 缓冲液（100 mmol/LTris-HCl、pH8.3，500 mmol/LKCl,15 mmol/LMgCl2)
2. 酶和酶缓冲液
MMLV 逆转录酶（100-200U/ul)
SUPERaseINRNA 酶抑制剂（20U/ul;Ambion)
Taq DNA 聚合酶（5U/ul)
3. 核酸和寡核苷酸
总 RNA(每个样品达到 2.5ug)
随机引物（50umol/L)
dNTP 混合物（10 mmol/L，包含所有四种 dNTP)
基因特异的正向引物（5umol/L)
基因特异的反向引物（5umol/L)
4. 放射性复合物
[a-32P]dCTP(10uCi/ul)(lCi=37 GBq)
5. 实验器材
Quantu mRNA Universal 18S standards (Ambion; 包括 18S PCR 引物对和 18S PCR 竞争子）
薄壁的 PCR 管
专用仪器
可编程的 PCR 仪
二、方法
1. 如方案 1 所述，集中运行单链 cDNA 合成反应，决定所有犇品的线性范围时使用同样量的 RNA。
2. 在冰上准备 PCR 反应混合物。
10XRT-PCR 缓冲液 50ul
10 mmol/LdNTP 混合物 40ul
5umol/L 基因特异的正向引物 20ul
5umol/L 基因特异的反向引物 20ul
18S rRNA 引物和竞争子（以方案 2 决定的比例添加） 40ul
5U/ulTaq DNA 聚合酶 rk; 2.5ul
[a-32P]dCTP(10uCi/Hl) 5ul
去除 RNA 酶的双蒸水 312.5ul
3. 在 9 个薄壁 PCR 管中分别添加 49ul 的 PCR 反应混合物。
4. 加 1ulddH20 于不加模板的对照管中。
5. 加1ul 每种样品 RNA 到相应的非反转录对照管中。
6. 加 1ul 从第一步 cDNA 合成反应中得到的每种样品的 cDNA 到相应的管中。
7. 做 PCR, 如方案 1 所述，使用扩增线性范围决定的最佳循环数。
8. 如方案 1 所述，用变性凝肢电泳来分析实验结果。不加模板的对照和非反转录对照应没有 PCR 产物产生。定置样品 PCR 产物的相对含量，可以用基因特异性产物的信号除以 18S rRNA 的信号，从而可以得到每个样品中基因特异产物的准确相对值，这些值可以用来比较样品间模板 RNA 的相对表达量。用样品 1 的标准化信号/样品 2 的标准化信号可以得到一个比值，以倍数或百分比表示。相对定量 RT-PCR 的实例见图 13-4。
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