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酶测定法实验

2020.8.17
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王辉

致力于为分析测试行业奉献终身

试剂、试剂盒 核心 RNA 聚合酶纯σ32 标准品纯化的 σ32 样品核心 RNA 聚合酶-σ32 复合物样品[α-32P]UTP终止液DEAE-纤维素(DE81) 纸片P04 清洗缓冲液乙醇反应液

仪器、耗材 水浴锅

实验步骤

材料与设备


核心 RNA 聚合酶 (2.3 mg/ml)


纯σ32 标准品 (0.8 mg/ml)


纯化的 σ32 样品,由 POROS 50S 阳离子交换柱洗脱所得


核心 RNA 聚合酶-σ32 复合物样品,由免疫亲和柱洗脱所得


[α-32P]UTP( 用 2.5uCi/ml 的反应液)


水浴,设定 37°C


终止液 (0.2mol/LEDTA)


DEAE-纤维素(DE81) 纸片


P04 清洗缓冲液(5%Na2 HP04)


乙醇(95%)


试剂


反应液


(配方,见“试剂的配制”,PP.184~189)


搡作程序


1) 用吸管取 50-ul 等分反应液(含 2.5uCi[α-32P]UTP/ml) 加入置于冰上的各试管。


2) 各加入 5ul 适当稀释的σ32 样品,混匀。一个样品应是标准制备物, 另一个样品应是由免疫亲和柱洗脱所得的核心 RNA 聚合酶-σ32 复合物。还应确保有一个“不含σ32”的空白对照以测定只有核心 RNA 聚合酶的掺入量,及一个“未孵育”的空白对照(加终止液于置冰上的试管, 但不在 37°C 孵育) 以测定本底。


3) 除含核心 RNA 聚合酶-σ32 复合物的各管和含纯σ32 标准的一管外,其佘各管均加 5ul 稀释的核心 RNA 聚合酶(总量 1ug)。


4) 各管 37°C 孵育 10 min 后,加 10ul 终止液终止反应。


5) 取各管反应液 25ul, 分别点在 DEAE-纤维素纸片上。


6) 将纸片放入烧杯,用预冷的 P04 清洗缓冲液洗 4 次,每次 100 ml 洗 5 min。前两次的清洗液倒入放射性废液容器。最后,分别用只 H20 和 95% 乙醇各洗一次。


7) 干燥纸片,进行放射性计数。


8) 对每个σ32 样品,取掺入量(已减去“未孵育”空白对照的本底对其加样量作图。确定每个样品相对于已知σ32 标准的活性。裉据每个样品的蛋白浓度,即可计算出相对比活性。

注:的另一活性是它与核心 RNA 聚合酶的结合能力。对此,可用非变性凝胶电泳分析核心 RNA 聚合酶转化为核心 RNA 聚合酶-σ32 复合物的情况来测定,如本单元实验 5 所述(PP.169~171)。


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