实验方法原理 抗坏血酸氧化酶在有氧情况下,能氧化抗坏血酸成脱氢抗坏血酸,同时促进其氢与空气中的氧结合成水。
抗坏血酸氧化酶的测定是在该酶的最适pH及适宜的温度下,向反应瓶中加入一定量的底物(抗坏血酸)及酶提取液,让酶作用一段时间,然后测定底物被消耗的数量来计算酶的活性。抗坏血酸被消耗的量,可用碘液滴定剩余的抗坏血酸来测定。反应式如下:
上述式中I2来自以下反应:
KIO3 + 5KI + 6HPO3 --→ 3I2 + 6KPO3 + 3H2O
实验材料 水稻黄化幼苗马铃薯块茎植物叶片
试剂、试剂盒 磷酸盐缓冲液抗坏血酸偏磷酸淀粉溶液碘酸钾配制碘液配制
仪器、耗材 研钵50 ml量筒50 ml三角瓶微量滴定管滴定架移液管移液管架恒温水浴洗耳球
实验步骤
一、实验步骤
1. 酶液提取
称取新鲜样品(水稻黄化苗2~3g,马铃薯块茎用5g)剪碎置研钵中,加少量石英砂及pH6的磷酸缓冲液,迅速研磨成匀浆(事先将缓冲液用冰水冷却,不使研磨时温度增高)。把全部材料用缓冲液洗入50 ml容量瓶中,定容至刻度。放在18~20℃水浴上浸提30min(其间摇动数次)。然后将上清液(酶浸提液)用棉花过滤于干净的三角瓶中备用。
2. 酶活性的测定
取3个50 ml三角瓶,标上号码,按下表准确加入各项试液:
先在各瓶中加入pH6磷酸缓冲液4 ml,0.1%抗坏血酸2 ml, 并向3号瓶加入10%三氯乙酸1 ml,以每隔1 min在各瓶中依次加入酶液3 ml(视酶活性增减酶用量),准确记录加入酶液的时间,摇勺后将各瓶在18~20℃水浴中酶促反应5 min后,立即向1、2号瓶各加入10﹪三氯乙酸1 ml,以终止酶的活动,然后各瓶加入1%淀粉液3滴作指示剂,用微量滴定管以mol碘液进行滴定,以出现浅兰色为滴定终点。记录滴定值。