膜蛋白的分离、鉴定及其功能分析—GFC/IEC/SDS-PAGE 和 MALDI-TOF-MS 实验试剂、试剂盒 分离缓冲液增溶缓冲液洗脱缓冲液Laemmli 样品缓冲液胶段冲洗缓冲液酶解缓冲液肽抽提缓冲液
实验步骤
3.1 膜的分离
因为在研磨材料时，要分离的膜组分以小囊泡形式与可溶的胞质蛋白质混合在一起，所以，最好在分离、鉴定膜蛋白前将这些胞质蛋白质去除掉。为了达到这个目的，我们需要用可穿透这些囊泡的达到临界微胞浓度（CMC) 的去垢剂溶液来分离膜组分( 见注释 1) ，使包覆亲水性蛋白质慢慢地向外扩散。增溶缓冲液还含有一种离液盐和一种二价金属螯合剂用来解离松散结合在膜周边的蛋白质。这里所介绍的分离植物质膜的实验过程见图 22-1。
( 1 ) 将 0.5~5 mg 的膜组分悬浮在分离缓冲液中（浓度为：0.2 mg/ml) ，4°C 搅拌混匀。
( 2 ) 测试时间可长达 4 h。
( 3 ) 经过处理后，将膜悬浮液于 4°C，100000 g 离心 1h。
( 4 ) 测定上清液和沉淀的蛋白质含量。
( 5 ) 在 SDS-PAGE 上分析膜外周蛋白质组分（上清液）和膜内镶嵌蛋白质组分 ( 沉淀）的条带。
3.2 蛋白质增溶
分离膜镶嵌蛋白质首先需要使用去垢剂打破其天然脂环境 [ 8，9] 。这里介绍的方法中，我们使用中性或两性离子去垢剂，因为这两种去垢剂不会修饰由 IEC 分离出来的蛋白质的电荷。而且这两种去垢剂作用温和，能保持蛋白质的天然构象与活性。
( 1 ) 用 1 ml 增溶缓冲液室温下增溶 0.5~5 mg 分离出来的膜组分。
( 2 ) 添加 1 ml DM 溶液于增溶缓冲液中，使 DM/蛋白质比例（m/m) 达到 3~7 ( 见注释 2) 。
( 3 ) 涡旋混匀 2 min，室温下低速搅拌，增溶处理 2 h。
( 4 ) 室温下 190000 g 离心 1 h。
( 5 ) 定量分析上清液和沉淀中的蛋白质，获得增溶产量。
( 6 ) 在 SDS-PAGE 上分析溶解蛋白质（上清液）和不溶解蛋白质（沉淀）的条带。
经过这些步骤可获得与初始 PM 蛋白质很相似的溶解蛋白质的 SDS-PAGE 图谱 ( 图 22-2)，约有 85% 的初始蛋白质可经上述实验过程溶解出来。
3.3 色谱层析
1. IEC/SDS-PAGE 分离
使用 Mono Q HR 5/5 层析柱（Pharmacia/Amersham Biosciences 公司）进行阴离子交换色谱层析（A EC，见注释 3) ，在整个层析过程中，用 280 nm 吸收监测蛋白质洗脱，并设定组分收集容积为 0.3 ml。样品和洗脱缓冲液中的去垢剂容易在管道系统中形成泡泡，因此，建议小心超声处理（30 min ) 缓冲液和调整洗脱速度（0.5~1 ml/min) 。
( 1 ) 室温下，用 15 ml 洗脱缓冲液平衡层析柱。
( 2 ) 将新增溶出来的蛋白质（0.5~2 mg 蛋白质，2 ml 溶液）上样到层析柱上，当收集组分时，用 5 ml 洗脱缓冲液冲洗柱子。
( 3 ) 用 10~15 ml 线性盐梯度（在洗脱缓冲液中含 0~1 mol/L NaCl 盐浓度）洗脱蛋白质。
( 4 ) 用 5 ml 含有 1 mol/L NaCl 的洗脱缓冲液冲洗柱子，将柱子里的残留样品洗出。
( 5 ) 在收集的组分中加入冷丙酮 [ -20°C，80% ( V/V) ] ，于 -20°C 下过夜，用以沉淀蛋白质。
( 6 ) 用微量离心机 4°C 条件下 17000 g 离心 30 min。
( 7 ) 在上述用丙酮沉淀的蛋白质样品中加入 50 μl 的 Laemmli 样品缓冲液，涡旋振荡，并超声波振荡处理（超声波水浴中处理 15 min) ，重悬沉淀的蛋白质。
( 8 ) 用 SDS-PAGE 分离蛋白质条带。
具代表性的 IEC/SDS-PAGE 分离方法（从 0.5 mg 酵母质膜增溶出来的蛋白质幵始）见图 22-3A。我们可以看到 3~6 个连续收集的组分中都含有同一条带，用 MALDI-TOF/MS 可以从 70% 的电泳条带中鉴定出一个蛋白质，从 5%~25% 的条带中鉴定 2 个或 3 个蛋白质（图 22-3B) 。比较连续排列的不同处理的同梯度洗脱下来的阴离子交换层析（AEC ) 组分的 SDS-PAGE 泳道来进行数据分析。
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