3.2 等电聚焦（IEF)

各种长度（如 7 cm、13 cm、18 cm、24 cm ) 和不同 pH 范围的固定化 pH 梯度 ( IPG ) 胶条可供使用。IPG 胶条常在 20℃ 下（温度低于 20℃ 可导致尿素结晶）于适量水化液中水化过夜（16 h ) 。这可在溶胀托盘 （ re-sweling    tray ) 或直接在胶条槽（stripholder) 内完成。无论选取何种方法，必须保证胶条和容器底部间的气泡都被移除。该步完成后，胶条需覆盖上不导电的油。如果水化是在溶胀托盘内进行的，还必须转移到胶条槽上运行。IEF 参数设置取决于胶条长度 ，但始终在 20℃ 完成。若温度高于 20℃，可能导致蛋白质修饰，如尿素产生的 氰酸铵（ammoniumcyanate) 导致的氨甲酰化 ( carbamylation ) 。一旦等电聚焦完成，沥去多余的覆盖油，储存胶条于 -80°C 。本说明假定使用的仪器是 GE Healthcare IPGphor。

胶条水化

( 1 ) 对于 24 cm IPG 胶条：融化 4 ml 水化液，加入 DTT 和 IPG 两性电解质至以下浓度：DTT 40 mmol/L；两性电解质 0.5%（V/V）。

( 2 ) 对于 pH 3~10 的 IEF，加入适量的样品至水化液中，使每根胶条上样 400 μg 蛋白质。理想条件下每根胶条须用 50~100 μl 样品。对于 24 cm 胶条，蛋白质样品和水化液的总体积应为 450 μl。理想条件下水化液：样品比例不应小于 3:1。

( 3 ) 无论水化是在 IPG Manifold ( 多功能盘）还是直接在单根胶条槽内进行，用移液器从 24 cm、12 道槽的溶胀托盘（reswelling   tray ) 的槽一端加入 450 μl 缓冲液和蛋白质混合液（见注 4) 。

( 4 ) 对于 pH 6~11 间的 IEF，除了两性电解质以 pH 6~11 代替 pH 3~ 10 外，所用蛋白质和缓冲液的总体积与 pH 3~10 —样。此外，水化液是从槽一端加入，样品单独加在正极端（+ ) 。

( 5 ) 放置干胶条（ ImmobilineDryStrip )，胶面朝下，置于溶胀托盘的槽中，确保胶条下无气泡。

( 6 ) 用 DryStrip 覆盖油覆盖，加盖封上，20℃ 水化 16~18 h ( 过夜）。

( 7 ) 取走胶条（使用镊子），去除多余覆盖油。

( 8 ) 胶面朝上，放入 24 cm IPGPhor  Manifold 多功能盘中（ 最多可达 12 根） 。

( 9 ) 将胶条排列在每个槽的中间，以 DryStrip 覆盖油覆盖。即使未使用，也要将所有槽内填入覆盖油。

( 10 ) 润湿电极滤纸片，吸去多余水分。

( 11 ) 将电极滤纸片置于胶条的两端，轻微接触胶条。

( 12 ) 将可移动电极固定于 24 cm  IPGPhor  Manifold 多功能盘中。将电极置于滤纸片与胶条接触部分。

( 13 ) 固定好电极位置，盖上 IPGPhor 电泳仪的盖子。

( 14 ) IEF 运行的条件必须根据不同的提取物凭经验决定。但以下参数适用于面粉 /Tris - CaCl2 法提取物：500 V 、1 h；1000 V、1 h；8000 V、8.20 h。总计 65500 Vh。

( 15 ) IEF 结束后，移出胶条，除去多余覆盖油，将胶条置于 10 ml 塑料吸管中 ( 去掉尖端使胶条能放入）。用封口膜密封，储存于 -80℃。

3.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)

3.3.1 使用仪器为 GE Healthcare  Ettan  Dalt   II

( 1 ) 玻璃板用清洁剂浸泡过夜，去离子水冲洗，再用乙醇和 RO ( 反渗透）水冲洗，风干。

( 2 ) 根据使用说明书将凝胶板组装（见注 5 关于硅密封胶的使用，如果使用的是非自封的胶板，确保胶板四周完全密封）。

( 3 ) 制备多块胶时，在每块凝胶盒间用可重复使用的塑料垫片隔开，将凝胶盒装入制胶盒。保证凝胶盒紧密填充，且通过用硅脂涂抹橡胶密封垫使前板与灌胶盒形成完好密封。拧紧面板上的螺栓，水平放置灌胶盒。

( 4 ) 接上制胶管和漏斗，用夹钳和立架保持垂直。

( 5 ) 如使用取代液，漏斗准备就绪后加入 100 ml 替换液至平衡室。如果不使用替换液，在灌胶后可通过用大量 热水从管内冲走聚合的丙烯酰胺。

( 6 ) 12 块 10% 的凝胶使用 1 L 凝胶溶液：250 ml 1.5 mol/L Tris - HCl，pH 8.8；333  ml 30%  ( V/V )   Duracryl 0.65%  (m/V )  bis；407 ml 水。搅拌，置于 2 L 布氏烧瓶中除气 15 min。

( 7 ) 加入 10 ml 10%  (m/V) SDS，稍加搅拌。

( 8 ) 用前加入 2.5 ml 10% APS 和 0.5 ml TEMED，搅拌。

( 9 ) 将丙烯酰胺溶液灌入漏斗，不断补足（重要的是不能使漏斗中溶液完全流空，否则会在胶内形成气泡）。持续加液直至胶面离第一块前板顶端 1~2 cm ( 约 1 L ) 。

( 10 ) 移去漏斗，使替换液向下流入灌胶模具（caster ) 底部的 V 形槽。

( 11 ) 在每块胶顶端覆盖 1 ml 水饱和正丁醇，放置 3~4 h 待凝胶聚合。

( 12 ) —旦聚合完成，拆除灌胶盒，移去凝胶盒，用去离子水漂洗凝胶盒以去除水饱和丁醇，以及少量附着在凝胶盒外面上的小块凝胶。

( 13 ) 配制 1 : 4 ( RO 水）稀释的 1.5 mol/L Tris-HCl ( pH 8.8 ) 作为凝胶存储液使用。

( 14 ) 将凝胶置入一个大的塑料盒，加入足够的凝胶存储液以完全覆盖凝胶。

( 15 ) 凝胶在 2~4℃ “成熟” 10~14 天之后可供使用，但从制胶之日起一个月以后不能再用。

3.3.2 凝胶电泳

( 1 ) 每根 IPG 胶条用 10 ml 冻存的预制平衡液，在 4℃ 冰箱或冷室解冻过夜。

( 2 ) 准备 7 L下槽液：25 mmol/L Trizma 碱，15 mmol/L 冰醋酸。

( 3 ) 将缓冲液倒入 Ettan Dalt ll 槽，打开泵冷却到 15℃。

( 4 ) 准备上槽液：3 L 200 mmol/L Tris 碱，0.4% (m/V)  SDS，200 mmol/L Tricine。

( 5 ) 用水冲洗 IPG 胶条去除多余覆盖油，在含 1% (m/V)  DTT 的 10 ml 平衡液中平衡 15 min。

( 6 ) 弃去平衡液，再加入 10 ml 含 4% (m/V) 碘乙酰胺的平衡液温育 15 min。由于碘乙酰胺感光，管子外要包上铝箔。

( 7 ) 将第二向胶从冷藏处取出，用上槽液清洗凝胶顶端 3 或 4 次。

( 8 ) 向凝胶盒槽内填灌上槽液，并加载胶条。按惯例，胶条的酸性端是在凝胶的左边。确保胶条和凝胶间没有气泡存在。

( 9 ) 润湿凝胶盒边缘，以顺利穿过橡胶密封管的通路，将凝胶放入电泳槽。如果不足 12 块胶，则使用 Perspex空白。

( 10 ) 加入上槽液，避免影响凝胶盒槽，盖上盖子，使用以下参数运行： 第 1 步：恒功率= 60 W ( 5 W/胶）；时间 0.15 h；温度 = 15℃；泵 = 自动。第 2 步：恒功率=120 W ( 10 W/胶）；时间 2 h；恒功率 = 240 W  ( 20 W/胶）；时间 6 h；温度 = 15℃；泵 = 自动。

( 11 ) 当染料前沿离胶底端 0.5~1.0 cm 时停止电泳。总的运行时间约 8 h。

( 12 ) 撬开玻璃盒，每块凝胶切角以指示方向。将凝胶置入合适的染液（ 见后述 ）。