蛋白质质谱鉴定技术概述及常见问题解决方法

2020.9.06

qi

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　　蛋白质（Protein）是生物体中含量最高，功能最重要的生物大分子，存在于所有生物细胞，作为生命的物质基础之一，蛋白质在催化生命体内各种反应进行、调节代谢、抵御外来物质入侵及控制遗传信息等方面都起着至关重要的作用，因此蛋白质也是生命科学中极为重要的研究对象。

　　现代研究结果发现越来越多的多肽同蛋白质一样具有生物功能，建立具有特殊、高效的生物功能肽的肽库是现在的研究热点之一。因此需要高效率、高灵敏度的肽和蛋白质序列测定方法支持这些研究的进行。现有的肽和蛋白质测序方法包括N末端序列测定的化学方法Edman法、C末端酶解方法、C末端化学降解法等，这些方法都存在一些缺陷。例如作为肽和蛋白质序列测定标准方法的N末端氨基酸苯异硫氰酸酯 PITC分析法，测序速度较慢，通量低；样品用量较大，对样品纯度要求很高；对于修饰氨基酸残基往往会错误识别等。C末端化学降解测序法则由于无法找到PITC这样理想的化学探针，其发展仍面临着很大的困难。在这种背景下，质谱（Mass spectrometer）由于相对较高的灵敏度、准确性、易操作性、快速性及较好的普适性而倍受科学家的广泛应用。

　　蛋白的质一级结构式氨基酸序列，通过鉴定氨基酸序列来匹配它的蛋白质，这是定性研究，是蛋白质组学研究的基础。现在蛋白质组学基本研究手段是：以生物质谱技术为核心，对蛋白质进行大规模、高通量分离、鉴定和分析。现代质谱一般由离子源（Ion source）、质量分析器（Mass analyzer）和离子检测器（Detector）三部分组成。

　　在对简单蛋白质样本，比如双向凝胶（2D gel）蛋白质点、单维胶（1D gel）切割下来的蛋白质条带（Band）以及纯化蛋白等，均可选用离子源为电喷雾电离（ESI）或者基质辅助激光解吸离子化（Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization, MALDI）的质谱来进行鉴定。ESI原理是在喷雾器顶端施加一个电场给微滴提供净电荷，在高电场下，液滴表面产生高的电应力，使表面被破坏产生微滴。荷电微滴中溶剂的蒸发，微滴表面的离子“蒸发”到气相中，进入质谱仪。MALDI的原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给生物分子，而电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，而使生物分子电离的过程。

　　1. 如果选择MALDI-TOFTOF进行蛋白质鉴定，需要提供多少样品？

　　如果是考染的2D胶点或者是条带，只要是肉眼可见均可保证一个比较好的成功率。或者提供大于200 fmol（或 10ng左右50kDa左右的蛋白质）鉴定成功率也很高。如果是溶液或者是冻干样品，蛋白质含量至少需要100ng。

　　2.蛋白胶点鉴定时，2-DE采用银染染色的方法，请问哪些银染试剂会对后续的质谱鉴定产生影响？

　　银染试剂里不要使用戊二醛，因为它会对蛋白进行修饰，这样会影响后续的蛋白鉴定。该染色方法见与质谱兼容银染染色方法。

　　3.怎样减少角蛋白的污染？

　　角蛋白的污染主要来自于头发和皮屑，所以在实验和切胶过程中应带好手套和头套。

　　4. 胶点需要合并吗？

　　对于考染样品只要肉眼可见一个胶点即可。银染样品建议4个单独点合并，但一般情况下我们建议银染样品用

　　LC-MSMS进行鉴定。

　　5. 关于样品保存时间问题？

　　我们推荐是新鲜制备的样品马上进行质谱鉴定。银染样品的保存时间最好不好超过2个月，考染样品可以保存几个月以上，但是最好也不要超过6个月。

　　6. 接受已经酶解的样品吗？除了Trypsin酶以外，会用其他的酶进行酶解吗？