第二天:
将上述物品揭开,将胶正面朝下,膜正面朝上,用铅笔作好标记。
将胶浸泡在EB中1-2分钟,用DEPC H2O清洗,将膜放在滤纸上面,夹好,4度下保存,或者直接进行预杂交。
UV杂交(有助于RNA结合到膜上面)。
五、预杂交和杂交
预杂交和杂交 buffer: 100ul
20×SSC 25ml (5×SSC)
甲酰胺 50ml (50%)
N-lauroylsarcosine: 0.1g(0.1%)
20% SDS 100ul(0.02%)
blocking reagent 2g(2%)
DEPC H2O 25ml
(一)预杂交:
预杂交buffer 在55-65度下加热,温度取决于探针的质量。如果温度低,则会得到更多非特意的条带:对于周探针较好。如果温度高,则会得到高结合力的条带:探针较好。
把膜装进一个塑料袋中,RNA在一边,密封。
在预杂交buffer中培养,55-65度,轻摇,过夜。越长越好。但是要确保溶液盖到膜。
(二)杂交:
buffer 在55-65度下加热,弃去塑料袋中的预杂交buffer,将探针buffer装进,55-65度下培养过夜,轻摇。
注意:预杂交和杂交都是在同一温度下进行。
杂交后:
1、 清洗:室温下用2×SSC,0.1%SDS清洗,5分钟,2次。
2×SSC, 0.1%SDS
10 ml 20×SSC
500ul 20%SDS
加DEPC H2O 至100 ml
2、 清洗: 55-65度,用0.1-0.5 SSC清洗2次,每次15分钟。
SSC buffer 的浓度、温度取决于探针的质量。浓度越低、温度越高,则会得到更高的效果。
Buffer在使用之前要先加热。
3、清洗
室温下用1×MA-T清洗,1分钟,1次。
1×MA-T
100ml 10×MA
900ml DEPC H2O
3ml Tween 20 (占总的0。3%)
10×MA(室温下储存)
1M 顺丁烯二醛
1.5M NaCl
不容易溶解,可以加入70gNaOH 调节到1L。并且调节PH=7。5
4、阻断:
室温下blocking buffer,30 min
blocking buffer
1g 阻断剂
100ml 1×MA-T
稍微加热充分溶解。
5、DIG- Ab
室温下用Ab- blocking buffer,30 min
Ab :blocking buffer= 1:5,000
重要:抗体离心后取出上清液
6、清洗
室温下用1×MA-T清洗,15分钟,2次。
7、检测
(1)将膜用 detection buffer 培养2-3分钟,即清洗一遍。
detection buffer
100mM Tris-HCL
100Mm NaCl
PH=9.5
(2)将膜取出,置于塑料薄膜上。
(3)用适量的CDP-Star(约1毫升),将膜均匀润湿,涂匀,将塑料薄膜合上,中间不能有空气和皱折。 等待5分钟。
(4)用吸水纸将膜边缘的CDP-Star吸去,用热将塑料薄膜密封。
(5)检测(暗室操作,去校医院放射科)。
(6)分析统计。