2．利用末端转移酶和α-32P-ddNTP标记DNA的3ˊ-末端
在二价阳离子存在下，末端转移酶催化dNTP加入DNA分子的3ˊ-羟基末端，如果作为底物的核苷酸经过修饰（如ddNTP），则可以在DNA的3ˊ-OH上仅加入一个核苷酸。对于双链DNA片段，亦存在DNA的两侧均被标记问题，可通过上述同样的方法分离。
图7-20 对双链DNA进行不对称标记的常用方法
3．利用Klenow片段和α-32P-dNTP对限制性内切酶产生的3ˊ-凹进末端进行标记
这种方法能直接制备单侧末端标记的DNA，但要求待测DNA能满足下列条件之一：①DNA两端的一侧为3ˊ-凹进末端，而另一侧为平端或3ˊ-凸出末端；②两端虽均为3ˊ-凹进末端但末端单链结构不同，这时可选择不同的γ-32P-NTP来实现末端标记。这是对双链DNA进行不对称标记的常用方法，如图7-4-4所示。
CS载体系列（CS是chemical
sequecing的缩写）是专门为化学降解法测序进行末端标记而构建的一类克隆载体，如pSP64CS和pSP65CS。这类载体最重要的特点是，在待测DNA克隆片段的附近有两个可被限制性酶Tth111识别的典型位点（GACN↓NNGTC，不对称），能在克隆DNA片段两侧不同的3ˊ-凹进末端，从而方便地实现对待测DNA的单侧标记。
值得特别注意的是，化学降解法对标记的待测DNA纯度有较高的要求，因为盐浓度会干扰肼对胸腺嘧啶的修饰，也会抑制A+G反应中的去嘌呤过程。因此，标记的DNA一般要经酚/氯仿抽提、70%乙醇洗涤除盐，并用去离子水溶解而不用TE缓冲液。
㈢ 碱基特异的化学切割反应
在化学降解法中，专门用来对核苷酸作化学修饰并打开碱基环的化学试剂主要有肼（hydrazine）和二硫酸甲酯（dimethylsulphate）。
肼又叫联氨（NH2-NH2），在碱性条件下，能作用于T/C的C4和/或C6原子位置，并同C4-C5-C6环化形成一种新的五元环。肼进一步作用释放出吡唑啉酮环。在六氢吡啶的作用下，通过β消除反应，该碱基两端的磷酸基团便会以磷酸分子形式从糖环上释放出来，从而导致在这个核苷酸位置上发生DNA断裂如果在此反应体系中加入1mol/L浓度的盐，则肼同T的反应速率会下降，便可发生C特异的化学切割反应。因此，可以根据这一特点来区别C和C+T这2种化学切割反应。化学反应过程如图7-21所示。
二硫酸甲酯[(CH3O)2SO2]，能使DNA碱基环中的氮原子发生甲基化反应。在DNA测序分析中所涉及的甲基化位点是G的N7原子和A的N3原子。在中性pH环境中，这2种碱基的甲基化作用，都足以导致其糖苷键发生水解作用，而留下失去碱基的糖-磷酸骨架。再通过碱催化的β-消除反应水解无碱基糖环两端的磷酸二酯键，造成DNA在此位点发生断裂。同时，已知DNA中G的N7原子甲基化速率比A的N3原子快4~10倍，故在中性条件下水解速率G位置也比A位置要快得多（差4~6倍），这是早期Maxam-Gilbert化学降解法测序辨别DNA中G和A的基本依据。现行的化学裂解反应，都采用六氢吡啶与DNA中的甲基化碱基反应，且这种反应对甲基化的G是特异的，因此这种DNA链的断裂也仅发生在G残基位点。化学反应过程如图7-22所示。
化学反应设有5组独立的反应：G反应（在G 残基上的裂解）、A+G反应（在嘌呤残基上的裂解）、C+T反应（在嘧啶残基上的裂解）、C反应（在C残基上的裂解）和A＞C反应（在A和C 残基上的裂解），A＞C反应也可以不做。
㈣ 测序图谱的识读
对于测序电泳图谱的识读，化学降解法测序要比末端终止法较为复杂，因为化学裂解反应并非是完全绝对碱基特异的。每组测序图谱为5条或4条（A＞C反应可以不做）泳道。需要通过从C+T泳道出现的条带中扣除C泳道的条带而推断T残基的存在。类似地，A残基的位置也要通过从A+G泳道中扣除G泳道的条带推断出来。同时，如果A＞C泳道中出现较强的条带，则可确证A残基的存在。
实际读片时从胶片底部一个个地向顶部读取。从下至上，一个一个地从G+A泳道和C+T泳道二个列中确定只相差一个碱基的条带。如果在G+A泳道中出现一条带，就看G泳道中是否有相同大小的带，如果有即为G碱基，如果没有则为A碱基；同样，在C+T泳道中出现的条带，就检查C泳道中有无同样大小的条带，如果有即为C，无则为T。如果做了A＞C反应，在该列中出现较强的条带时，可帮助A的确定。
㈤ 化学降解法测序的优点
在化学降解法与链终止法问世之初，利用化学降解法进行测序不仅重复性更高，而且由于只需要简单的化学试剂和一般的实验条件，易为普通实验室和研究人员所掌握。而链终止法需要单链模板、特异的寡核苷酸引物和高质量的大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow片段），这在二十世纪八十年代一般的实验室很难做到。但随着M13mp载体的发展、DNA合成技术的进步及Sanger法测序反应的不断完善，至今DNA测序已大都采用Sanger法进行。然而，Maxam-Gilbert法可对合成的寡核苷酸进行测序，可以分析DNA甲基化修饰情况，还可以通过化学保护及修饰等干扰实验来研究DNA的二级结构和DNA与蛋白质的相互作用，这些仍然是Maxam-Gilbert法所独具的鲜明特点。
当然，如同双脱氧终止法一样，化学降解法测序的主要限制因素也是测序凝胶的分辨能力。化学测序法一般都用32P标记，所以与用32S标记作标记的末端终止法相比，它显示的条带较宽且有扩散现象，这限制了化学降解法在对较大DNA片段测序时的分辨能力。一般一块电泳胶上最多能读出200~250核苷酸序列。然而，如果按2个相反的取向分别从DNA片段的两端进行测序，则可克服这一不足。
三、DNA序列分析的自动化
双脱氧终止法和化学降解法自1997年提出并的逐渐完善，无疑是目前公认的二种最通用、最有效的DNA序列分析方法，Sanger、Maxam和Gilbert等人也因此分享了1979年度诺贝尔化学奖。但实际操作中都存在一些共同的问题，如放射性核素的污染，操作步骤繁琐、效率低和速度慢等缺点，特别是结果判断的读片过程实在是费时又乏味的工作。随着计算机软件技术、仪器制造和分子生物学研究的迅速发展，DNA自动化测序技术取得了突破性进展，以其简单（自动化）、安全（非同位素）、精确（计算机控制）和快速等优点，已成为今天DNA序列分析的主流。
DNA序列分析的自动化包括两个方面的内容，一是指“分析反应”的自动化，更重要的一方面则是指反应产物（标记DNA片段）分析的自动化。虽然各种DNA自动测序系统差别很大，但Sanger法所采用的DNA聚合酶和双脱氧核苷酸链终止的原理，亦是现今自动化测序的最佳选择方案。即大都沿用Sanger的双脱氧核苷酸链终止法原理进行测序反应，主要的差别在于非放射性标记物和反应产物（标记DNA片段）分析系统。仅举例简介其基本原理：
㈠ ALF全自动激光荧光DNA测序系统
ALF自动DNA测序系统，是由德国海德堡欧洲分子生物学实验室（EMBL）等提出和设计的。该系统采用非放射性的单一Cy5荧光素标记测序引物。沿用双脱氧链终止法进行反应，分别生成4组终止于不同种类碱基、带有Cy5荧光素标记的DNA片段。A、G、C和T四组反应物在变性凝胶上电泳，每个泳道都有一个由激光枪和探测器组成的检测装置，当Cy5荧光素标记的DNA条带迁移至探测区并遇上激光时，荧光标记被激活并释放出光信号，光信号由光探测器接收；最后电脑将收集到的信号（原始数据）进行处理，获得样品DNA的最终序列。
ALF系统包括电源、电泳系统、探测系统、驱控系统（计算机）和输出设备（绘图仪）等。与传统的手工操作测序相比，ALF系统能直接获取原始数据并及时加以处理。该系统在仪器硬件和驱动软件的设计上都进行了不断的改进，近年推出了ALF
expressTM全自动激光荧光DNA测序仪。该仪器设计独特，可提供快速可靠的核酸测序、片段分析和突变检测。目前广泛应用于人类基因组计划，在此种大规模序列测定中，该仪器起到了重要的初筛作用。
㈡ ABI型全自动DNA测序仪
ABI测序仪是由Perkin
Elmer（PE公司）推出的DNA自动化测序仪。其特点是采用ZL的4种荧光染料分别标记终止物ddNTP或引物，经Sanger测序反应后，反应产物3′端（标记终止物法）或5′端（标记引物法）带有不同的荧光标记。一个样品的4个测序反应产物可在同一泳道内电泳，从而降低测序泳道间迁移率差异对精确性的影响。通过电泳将各个荧光标记片段分开，同时激光检测器同步扫描，激发的荧光经光栅分光，以区分代表不同碱基信息的不同颜色的荧光，并在CCD（charge-coupled
device）摄影机上同步成像。电脑可在电泳过程中对仪器运行情况进行同步检测，结果能以电泳图谱、荧光吸收峰图或碱基排列顺序等多种方式输出。
ABI测序仪包括电泳系统、激光检测装置、power
Macintosh型苹果电脑、HP1600CM型彩色打印机、DNA序列分析软件以及DNA片段大小和定量分析软件（Gene
ScanTM）。该系统采用电脑单点控制整个DNA测序仪，包括电泳参数设置、数据收集、数据分析及结果输出等。目前PE公司已生产出377,373,310和3700型DNA测序仪。377型全自动DNA测序仪为最新产品，具有可一次测定多个样品（64个以上）、测序精确度高和每个样品判读序列长（约700bp）等优点。测序速度高达200bp/h，比373型效率提高了许多。
ABI测序仪在人类基因组测序和cDNA测序研究中应用最为广泛。此外，亦可以使用各种辅助软件进行DNA定量分析和大小分析，故可广泛应用于基因突变分析（SSCP）、DNA指纹图谱分析、基因连锁图谱分析及基因表达水平分析等。
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