如何利用新型固定床生物反应器开发高产量活病毒疫...-1

如何利用新型固定床生物反应器开发高产量活病毒疫苗生产平台

摘要：病毒疫苗生产日益增加的重要性，推动了细胞高密度培养生产工艺的发展。传统的细胞贴壁培养工艺有一定的物理局限性，如较大的设备占地、时间和较多的劳动力。我们通过新型一次性scale-Xcarbo生物反应器建立的病毒疫苗生产系统，解决了这种限制。该单元结构紧凑，且可规模放大，并且可实现与生物感应器罐连接进行连续的下游纯化及浓缩工艺。Vero细胞是病毒疫苗生产中使用最多的贴壁细胞系之一。本文中使用Vero细胞ZL细胞系进行含拉沙热病毒糖蛋白的活性重组水泡口炎病毒疫苗生产。本文中，进行了代谢物分析，并比较了传统摇瓶、细胞工厂以及scale-Xcarbo生物反应器的病毒产量。相比传统细胞培养瓶的2.67x10⁶ pfu/cm²以及细胞工厂的5.77x10⁸pfu/cm²，一次性使用生物反应器单位面积可生产高2-4 log的滴度，约为5x10¹⁰ pfu/cm²。该新型生物反应器平台，可实现经济高效和可规模放大的病毒疫苗生产。

1. 简介

一次性使用的固定床生物反应器作为贴壁细胞培养平台，可用于多种不同病毒载体、活病毒及基于病毒的疫苗的生产。此类生物反应器将平底器皿系统的低剪切环境和自动化及可放大性相结合。Pall的iCELLis^®和Eppendorf的Fibra-Cel^®系统已被用于病毒载体和活病毒的高产量生产。使用这种封闭式固定床生物反应器具有显著的优势，包括产品控制、较低的资源和材料需求、节省生产时间以及更低的单位剂量生产成本。最近上市的固定床产品是来自Univercells的scale-X 生物反应器系统。scale-X产品线提供一系列的生长表面积规格：scale-X hydro（<3m²）、carbo（10-30m²）、以及nitro（200-600m²）。该范围可实现用于临床批次生产的可放大工艺和产能。在Univercells产品线中，生物反应器高度增加，而直径保持恒定。例如，carbo 10m²生物反应器高度为30m²生物反应器的1/3。而不同产品线之间的规模放大通过保持固定床高度恒定而增加直径来实现。例如，200m²生物反应器与10m²生物反应器具有相同的高度，但是直径不同。

scale-X carbo系统为一次性使用生物反应器，其偶联了以实验室规模自动化工艺控制器（pH、DO、T、搅拌、液体流速）操作的在线产物浓缩模块，可实现病毒产物的生产及同步浓缩；这是将这种固定床生物反应器与市面上其它产品区别开来的新特点。scale-X carbo生物反应器中的固定床可为细胞生长提供10至30m2的表面积（生长面积相当于120-360个滚甁、59-175个HYPERFlasks^®、16-48个CellSTACK^®-10层或6-16个HYPERStack^®-36层罐），根据表面积规格，罐总体积为1.6-3.2L。这可有助于获得更高的单位体积细胞密度以及紧凑的占地，从而整合在标准的生物安全柜内。

大多数商品化固定床生物反应器使用随机装填的圆盘或织物条，作为细胞贴附的底物；而scale-X生物反应器使用以筛网层组织的固定床，其可为细胞生长提供所需均匀性以及罐与罐之间的一致性。固定床由5cm2宽度的刚性聚丙烯筛网条带和非编织亲水性聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）织物交替螺旋管式组成，前者用于结构定型和培养基流动，后者用于细胞截留和贴附。这可实现均质的径向和垂直细胞分布以及通过筛网层的线性培养基流动，确保均匀的营养物质供应。取样端口安装在生物反应器顶盖内，可通过手动操作，监测培养过程中的细胞生长。该功能为细胞计数样品获取提供了一个快速且便利的接入点，避免罐内的交叉污染风险。通过将受控的混合气体供应至生物反应器的顶部空间（氧气供应、CO₂脱气），并允许通过下降膜液气界面吸收，实现环境控制，以支持细胞生长。

该生物反应器另一个与众不同的特点是在线中空纤维过滤器的使用，其可在生产阶段或收获时浓缩生产的产物。含有病毒的培养基灌流出生物反应器罐，进入专门的“收获”回流液容器中，而生物反应器内的培养基置换为新鲜的培养基。结果是可从生物反应器获得浓缩的小体积收获原液，从而简化下游操作，并降低其尺寸。在本研究中，我们在收获瓶前增加了在线澄清过滤器，以降低对中空纤维过滤器的污染。该系统可在单个标准尺寸的生物安全柜内进行所有上游工艺和初步的下游工艺。

由于scale-X carbo生物反应器舒适的人体工程学设计，我们选择该系统用于开发可放大的工艺，以生产基于重组水泡口炎病毒（rVSV）的拉沙病毒（LASV）疫苗。VSV是一种反义单链RNA病毒，可导致多种家畜的自限性疾病，且可感染人类，形成轻微的流感样综合征或保持无症状。VSV是一种有囊膜的子弹装病毒，粒径约70nm-200nm。较大的外源基因可包装进VSV并表达，使这种病毒成为理想的活病毒疫苗候选。此前，已经有报导构建了多种表达埃博拉病毒（EBOV）、马尔堡病毒（MARV）和LASV糖蛋白的载体。但是，用于生产物料所需的规模可能会是一个限制，特别是当使用贴壁细胞作为生产细胞时。在本报告中，我们证实了使用Univercells的scale-X生物反应器生产rVSV-LASV（VSVΔG/LASVGP）的工艺。与传统培养瓶生产工艺相比，使用scale-X carbo生物反应器生产获得的病毒产量可增加4-log。此外，实验检测了代谢物数据；谷氨酰胺、氨、葡萄糖和乳酸趋势均与病毒感染前生物反应器中的正常细胞生长一致。数据证实，相比传统的培养瓶生产，scale-X carbo生物反应器可获得更高的单位面积病毒产量，这将显著提升单次运行可生产的剂量数。总结来说，我们介绍了一种有能力在低环境足迹条件下，进行高产量病毒疫苗生产的新型可放大固定床生物反应器系统。

2. 材料和方法

2.1. 固定床生物反应器培养系统

所有实验使用10m² scale-X Carbo生物反应器（Univercells，Brussels，Belgium）和在线切向流过滤（TFF）组件（图1）。生物反应器以1.0-2.0x10⁴ cells/cm²的目标接种密度接种（按生厂商说明），细胞扩增阶段的工艺参数按生产商程序设置。培养参数确定为：温度35至37℃，pH 7.0至7.6，搅拌设置为250RPM，工作体积1.6L。外置的加热培养基循环回路连接至生物反应器，以支持高细胞密度。回路内的培养基体积足够大，以支持0.2-0.4mL/cm²的培养基与表面积比例。循环速度支持每天20-30个生物反应器体积。除基础补液管路为1/8”内径外，反应器上的管路尺寸大于1/4”内径。

2.2. 细胞扩增

Vero细胞系（Ology Bioservices Inc.）在专用无血清培养基（Ology Bioservices Inc.）中培养。细胞使用培养瓶和细胞工厂扩增，接种密度为1.0-1.5x10⁴cells/mL。罐置于37℃、5%CO2环境培养。细胞传代，直到达到约1.0-2.0x10⁹总活细胞量。收获时，细胞单层用1X DPBS缓冲液（Gibco，Waltham，MA）漂洗，以去除过量的耗竭培养基，之后使用TrypLECTS Select（Gibco，Waltham，MA）解离。离心去除TrypLE，细胞重悬于新鲜培养基。在Vi-CELL XR 细胞活性分析器（Beckman Coulter，Brea，California）上进行细胞计数。

2.3. 细胞密度和代谢物分析监测

插在固定床内的一次性使用采样条每日取出，使用裂解缓冲液和细胞核计数，确定细胞密度。采样条裂解5min，然后涡旋1min。细胞核用结晶紫染色，以观察完整的细胞核。通过从无菌采样端口提取培养基样品，使用BioProfile®FLEX2（Nova Biomedical，Waltham，MA）每日检测代谢物浓度。当离线检测偏离在线探针读数>±0.05pH单位时，执行pH偏移。

2.4. 感染过程

含有拉沙病毒（LASV）Josiah糖蛋白的重组水泡口炎病毒（rVSV）（去除糖蛋白G）（VSVΔG/LASVGP）由NIAID根据材料转移协议（LAB-18-P_LV-22仅用于体外使用，且仅用于培训和研究目的）慷慨提供。滴度为4.9x10⁸ pfu/mL的VSVΔG/LASVGP原液用于所有生物反应器感染研究。接种后5天或达到峰细胞密度（以谷氨酰胺检测的氮源剥夺为准）后，使用病毒接种液进行生物反应器感染。简单来说，生物反应器排干耗竭的培养基，然后灌满含有病毒接种液的新鲜培养基。循环回路在感染时断开，以进行批量模式感染。每个运行以MOI 0.05的感染复数感染，感染过程进行48至72h。一旦采样条上的细胞计数耗尽，开始收获。培养瓶容器在与生物反应器相同的时间，使用相同的病毒感染接种液，进行感染。

图1. scale-X carbo生物反应器。scale-X carbo系统示意图，30m²生物反应器（红色）位于生物反应器控制台中央。5L收获瓶位于控制台右手侧，在线TFF组件位于收获瓶后方。位于控制台左手侧的是控制面板，允许用户启动或暂停生物反应器泵。此外，接种液和基础培养基瓶位于生物反应器左侧。在描述的实验中，使用10m²，即为30m²生物反应器的1/3。外置循环回路未显示。