医学真菌检验技术（一）

       医学真菌学检查是诊断真菌病的重要依据，随着真菌感染病例的日益增多，对实验室的诊断也提出了更高的要求。不论是患者浅部或深部感染诊断，几乎全依赖于临床标本的真菌学检查。特别是系统性真菌感染，其早期特异的诊断方法是挽救患者生命的关键，而病原真菌的形态结构十分多样，在不同条件下同一真菌也可有不同特点的形态。因此，在真菌的实验室检查中，必须熟练掌握各类真菌的形态特征以及在不同条件下的演变规律，才能获得对致病真菌正确的诊断。目前真菌感染的实验室检查方法主要包括常规检查法和特殊检查法两类。常规检查法主要包括：①形态学检查(直接镜检+染色镜检)。②培养检查。③组织病理学检查。特殊检查主要包括：①血清学方法。②分子生物学方法。

       一、进行真菌实验室诊断的注意事项
 
       ①应有独立实验室，不应与其他细菌、病毒等实验室共用，以防发生相互污染。②在每天工作前与工作后，工作台均要以消毒水例如5%石碳酸或0.5%过氧乙酸 擦拭，如遇操作台被真菌或标本污染，应即覆盖纸巾，并用5%石碳酸消毒20min，切忌工作台污染后即用水冲洗，以免污染扩散。③培养菌检体及真菌污染的 物质在丢弃前，必须高压灭菌或焚烧。④在进行真菌检查时，不可试着闻平板培养基特殊的气味。⑤不可对Histoplasma capsulatum 以及 Coccidioides immitis进行载玻片培养技术，因为其等具有高度感染性的孢子能够随着空气传播。⑥实验室禁止任意养花、草、动物等生物，以防实验污染。⑦工作环境应 定期消毒。一般紫外线照射不能杀灭真菌，应用40%甲醛(可于每4㎡空间用35ml 40%甲醛加18g高锰酸钾在密闭情况下熏蒸24h，或用环氧乙烷进行消毒，每2～4周消毒1次。⑧如果用平板培养基接种标本，必须将平板培养基密封，以免发生危险，在不常做真菌检测的实验室，最安全的培养方法是利用含有棉花塞的试管培养基(使空气能够循环)。⑨美国梅育诊所主张利用平板培养基进行真菌的分离，步骤如下：平板培养基必须在生物安全箱内操作及检查。平板培养必须用胶带封好，平板培养基必须含30ml的量，并保持培养箱60%以上的湿度，同时增加琼脂的浓度至2%，以免脱水。⑩真菌的诊断，需要经验的累积及备有良好的图谱参考书。

       二、分离及鉴定真菌的培养基

       (一)配制培养基的一般原则

       ①各成分混匀后以文火缓慢加热，并不断搅拌，煮沸1min，过热会破坏有效成分。②分装试管应在高压灭菌前，而分装平皿应在高压灭菌后。③高压灭菌一般在118～121磅，10～15min。④需加血液或不能高压的成分如抗生素，应在培养基冷却至50左右时加入混匀。⑤试管分装量约7~8ml，平皿约15ml，如需培养4～6周，平皿内应有35～40ml的量。培养基中抗生素的浓度和添加方法：氯霉素、庆大霉素和放线菌酮能耐热，可在培养基高压灭菌前加入，其他抗生素均在培养基高压灭菌后冷却至45℃～50℃时加入。青霉素20～100μg/ml，链霉素40～200μg/ml，氯霉素50μg/ml，放线菌酮500μg/ml，庆大霉素5μg/ml。

       (二)分离和鉴定真菌的培养基

       各种医学真菌所用培养基的成分，又可根据不同要求，分成分离、富集、选择、特性研究等含不同成分培养基，具体见表。

       表 分离鉴定真菌培养基分类表

       培养基种类 分离用培养基

       使用目的

       1.Brain heart infusion agar 分离腐生性及病原性真菌
       2.Brain heart infusion agar with antibiotics 分离除了皮肤丝状真菌以外的真菌
       3.Brain heart infusion biphasic blood Culture bottles 从血液中分离真菌
       4.Dermatophyte test medium 分离皮肤丝状菌，建议仅做筛检用
       5.Inhibitory mold agar 分离除了皮肤丝状真菌以外的真菌
       6.Mycosel or mycobiotic agar 分离皮肤丝状菌
       7.Ssbouraud dextrose agar 分离腐生性及病原性真菌
       8.Yeast estract phosphate agar 分离除了皮肤丝状真菌以外的真菌

       区分试验培养基

       1.Ascospore agar 检测产子囊孢子酵母菌
       2.Cornmeal agar with Tween 80 and trypan blue 检测产厚膜孢子酵母菌
       3.Cottonseed conversion agar 使双相型真菌由霉菌型转变为酵母型
       4.Czapek’s agar 分离及区分Aspergillus spp
       5.Niger seed agar 鉴定Cryptococcus neoformans
       6.Nitrate reduction medium 检测Cryptococcus spp.还原nitrate能力
       7.Potato dextrose agar 证实Trichophyton rubrumm 产色素能力制作载玻片培养技术
       8.Yeast fermentation broth 测定酵母菌的发酵能力
       9.Yeast nitrogen base agar 测定酵母菌的糖类同化能力