(二) 真菌培养
从临床标本中对致病真菌进行培养，目的是为了进一步提高对病原体检出的阳性率，以弥补直接镜检的不足，同时确定致病菌的种类。真菌培养检查除需要一般细菌检验用到的器具外，还应准备真菌专用的接种针、接种环、或接种钩(用铂丝或镍丝制成)、微型小铲、刀片、针头等，常规分离鉴定使用的培养基为沙氏葡萄糖琼脂(SDA)斜面培养基，加0.05%氯霉素，还有多种性质的培养基(见第二部分)以满足各种不同的需要，可酌情选用接种的方法，根据不同的临床标本，大体可分为点植法和划线法两种。①点植法：适用于皮屑、甲屑、毛发、痂皮、组织等有形固体标本，将标本直接与培养基表面点状接触。②划线法：适用于痰、分泌物、脓液、组织液、组织块的研磨液等液体标本，用接种针(环)划线接种在培养基表面。
培养方法有多种，接临床标本接种时间分为直接培养法和间接培养法；按培养方法分为试管法、平皿法(大培养)和玻片法(小培养)。①直接培养：采集标本后直 接接种于培养基上。②间接培养：采集标本后，暂保存，以后集中接种。③试管培养：是临床上最常用的培养方法之一，培养基置于试管中，主要用于临床标本分离 的初代培养和菌种保存。④大培养：将培养物接种在培养皿或特别的培养瓶内，主要用于纯菌种的培养和研究。⑤小培养：主要用于菌种鉴定，大致分为三种：玻片 法，方块法和钢圈法。A.玻片法：在消毒的载玻片上，均匀地浇上熔化的培养基，不宜太厚。凝固后接种待鉴定菌株，置于平皿中，保湿。待有生长后，盖上消毒 的盖玻片，显微镜下直接观察，常用米粉吐温琼脂培养基观察白念珠菌的顶端厚壁孢子和假菌丝。B.方块法：适用于霉菌菌落的培养。取无菌平皿倒入约15ml 熔化的培养基，待凝固后用无菌小铲或接种刀划成1cm2大小的小块。取一小块移在无菌载玻片上，然后在小块上方四边的中点接种待鉴定菌株，盖上消毒的盖玻 片，放入无菌平皿中的V形玻棒上，底部铺上无菌滤纸，并加入少量无菌蒸馏水，孵育，待菌落生长后直接将载玻片置显微镜下观察。C.钢圈法：先将固体石蜡加 热熔化，取直径约2cm，厚度约0.5cm有孔口的不锈钢小钢圈，火焰消毒后趁热浸入石蜡油，旋即取出冷却，石蜡油即附着于小钢圈中。再取一无菌载玻片， 火焰上稍加热，将小钢圈平置其上，孔口向上。小钢圈上石蜡油遇载玻片的热即熔化后凝固，钢圈就会固定在载玻片上。用无菌注射器经孔口注入熔化的培养基，培 养基量约占小钢圈容量的1/2，注意避免气泡。待培养基凝固后取一消毒盖玻片，火焰上加热后，趁热盖在小钢圈表面，也即固定其上。最后用接种针伸入孔口进 行接种。这种方法的优点是形成一种封闭式培养，在显微镜下直接观察菌落时可避免孢子吸入人体，而且不易被污染，盖玻片也可取下染色后封固制片保存。
(三)培养检查
标本接种后，每周至少检查2次，观察以下指标：①菌落外观：A.生长速度：缓慢生长菌：7～14d，快速生长菌：2～7d。一般浅部真菌超过2周深部真菌超过4周仍无生长，可报告阴性。B.外观：a.扁平。b.疣状。c.折叠规则或不规则。d.缠结或垫状。e.其他。C.大小：菌落大小用cm来表示，菌落大小与生长速度和培养时间有关。D.质地：a.平滑状。b.粉状。c.粒状。d.棉花状。e.粗毛状。f.皮革状。g.粘液状。h.膜状。E.顔色：不同的菌种表现出不同的顔色，呈鲜艳或暗淡。致病性真菌的顔色多较淡，呈白色或淡黄色，而且其培养基也可变色，如马尔尼菲青霉等，有些真菌菌落不但正面有顔色，其背面也有深浅不同的顔色。菌落的顔色与培养基的种类、培养温度、培养时间、移种代数等因素有关。所以，菌落的顔色虽在菌种鉴定上有重要的参考价值，但除少数菌种外，一般不作为鉴定的重要依据。F.菌落的边缘：有些菌落的边缘整齐，有些不整齐。G.菌落的高度和下沉现象：有些菌落下沉现象明显，如黄癣菌、絮状表皮癣菌等，更有甚者菌落有时为之裂开。H.渗出物：一些真菌如青霉、曲霉的菌落表面会出现液滴。I.变异：有些真菌的菌落日久或多次传代培养而发生变异，菌落顔色减退或消失，表面气生菌丝增多，如絮状表皮癣菌在2～3周后便发生变异。②显微镜检查：小培养可置普通显微镜下直接观察，而试管和平皿培养的菌落则需挑起后做涂片检查。
五、组织病理学检查
真菌病的组织病理检查与直接镜检培养同样具有相当重要的价值，尤其对深部真菌病的诊断意义更大，如用特殊染色可提高阳性率。
真菌的组织病理反应与其他一些疾病的组织病理反应极其相似，往往只有在仔细研究了病理切片并发现了真菌之后才考虑到真菌病的诊断。而在这种情况下，标本已被固定，培养有时已不可能进行，组织病理切片就成了真菌感染的主要依据。所以临床上在送病理标本的同时，要尽可能考虑到真菌感染的可能，以便同时采集标本
送真菌实验室进行真菌学检查。
真菌在组织内一般表现为：①孢子：酵母和双相型真菌在组织内表现为孢子。②菌丝：许多真菌在组织中只表现为菌丝。组织中发现无色分隔、分支的菌丝多为念珠菌和曲霉。粗大、不分隔少分支的菌丝为接合菌，多为毛霉、根霉、犁头霉等。粗大、少分支有隔的菌丝为蛙粪霉菌。棕色菌丝为暗色丝孢霉病，由暗色孢科真菌引 起。③菌丝和孢子，主要见于念珠菌感染。④颗粒：为组织内由菌丝形成的团块。⑤球囊或内孢囊：球囊内含有内孢子，为球孢子菌或鼻孢子菌在组织内的特征性结构。
组织病理片中根据形态和染色能基本确定种名的真菌为：荚膜组织胞浆菌、杜波伊斯组织胞浆菌、副球孢子菌、皮炎芽生菌、链状芽生菌、粗球孢子菌、新生隐球菌和鼻孢子菌等。根据组织病理中真菌的形态能确定属而不能确定种的病为：放线菌病、奴卡菌病、无绿藻病、念珠菌病、曲霉病和不育大孢子菌病等。多个属的真菌 感染可引起相同的临床表现，在组织病理中真菌的形态无法区别的病有皮肤着生芽生菌病、暗色丝孢霉病、接合菌病、皮肤癣菌病和足菌肿等。足菌肿的颗粒若染色适当，很易确定为放线菌性或真菌性的，也能区别出细菌性颗粒。真菌性颗粒中的菌丝又分为无色或暗色两大类。各种病原菌基本上形成各自顔色、大小、形成和结构的颗粒，可以初步区别，但最后确定必须依靠真菌培养。
六、血清学方法
随着诊断技术的进展，以免疫学方法检测真菌病已成为可能，引起深部真菌感染的病原菌主要有白念珠菌、曲霉菌和隐球菌等，传统的检测方法主要为血培养 和组织活检，但血培养历时太长，且深部真菌感染的病原菌常不易培养成功，阳性率较低。而深部真菌感染的临床征象错综复杂，又使得组织活检缺乏典型改变，影响正确诊断，这些都使得这些方法所起的作用极为有限，真菌的抗原、抗体及代谢产物的血清学检查用于深部真菌感染的实验室检测，可取得很好的效果。目前常用的免疫诊断方法有：①特异性抗原的检测：A.乳胶凝集试验(LA)。B.酶联免疫试验(EIA)。C.荧光免疫测定法(FA)。②特异性抗体检测：由于受检者都为免疫低下患者，因其致阳性率低，故现已少用。
七、分子生物学方法
近年来随着分子生物学的发展，已有聚合酶链反应(PCR)扩增、分子探针、限制性酶切片段长度多态性分析(RFLP)、DNA指纹图谱、随机扩增DNA多态性(RAPD)等方法。用于深部真菌病的诊断和分型研究，形成了以PCR技术为基础的一系列分子诊断方法。从这些新技术对多种致病真菌鉴定的应用过程中发现，此类方法具有操作简便、省时省力、特异性、敏感性高的优点。特别是从分子水平对真菌从遗传进化角度阐明菌种间内在的分类学关系，真正达到人们追求已久的自然分类的目的。我们有理由相信，随着PCR及相关技术在临床的应用及更广泛深入的研究，将会对真菌感染的诊断和鉴定产生根本的影响。
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