2 ．艾滋病以及 HLTV—III 感染艾滋病是一种由人类 T 淋巴细胞病毒（ HLTV--III ）感染而造成的疾病。这种病毒主要侵袭 CD 4 + T 细胞，而导致 CD 4 淋巴细胞减少， CD 4 /CD 8 淋巴细胞比值下降，甚至可低到 0.5 以下。艾滋病多发生在同性恋性行为活跃的男性，这可能与多次重复感染 HLTV-III 有关。对异性性行为活跃的人来讲，对 HLTV—IIi 感染的机会也不容忽视。另一种感染的途径是 HLTV 血清阳性的献血者对受血者的感染。有部分人血液中 T 淋巴细胞减少， CD 4 /CD 8 比值下降，但 HTLV 血清反应不一定就是阳性。有些人 CD 4 减少不明显，但 CD 8 有所增加，也会导致 CD 4 /CD 8 的的比值下降。

　　对可疑为艾滋病及血清检验为阳性的人， T 细胞亚群是分析了解免疫系统被病毒破坏程度的标志。初诊时， CD 4 细胞越少， CD 4 /CD 8 值越低者，预后越差。所以经治疗后恢复的指标则是 CD 4 细胞数增加， CD 4 /CD 8 比值升高。用荧光标记双染色的 FCM 分析的结果表明，艾滋病人除 CD 4 和 CD 8 的改变外，同时还可以表现出 OKT 10 阳性细胞增多（图 10-15 ）。病人表现为 CD 8 和 OKT 10 同时增加时，预后比 OKT 10 阳性细胞低的病情严重。

图 10-15 　健康人艾滋病人淋巴细胞表面抗原的比较

艾滋病人 Leu 3 + 、 Leu 8 - 和 Leu 3 + 、 Leu 8 + 细胞均减少，而 Leu 2 + 、 Leu 8 - 细胞相应增加，

Leu 2 + 、 Leu 7 + 与 Leu2 3 + 、 Leu 10 + 细胞明显增加

3 ．白血病和淋巴瘤的表现型　近年来，为了弄清这些肿瘤的病理组织形态、影响治疗效果的原因与免疫状态的相互关系，对于不同类型的白血病和淋巴瘤作为广泛的细胞表面表现型的研究。

　　在诊断方面， FCM 与单克隆抗体结合，可以弄清这些肿瘤的免疫起源，特别是分清 B 细胞性、 T 细胞性或骨髓性肿瘤。同时，还可以证实一些与细胞起源相关的抗原，如普通急性淋巴细胞性白血病抗原（ CALLA 、 CD 10 ）。另外，可以用适当的试剂从反应免疫过程中来证实单克隆的肿瘤细胞的增殖。

　　大部分淋巴系统肿瘤均起源于 B 细胞。而 B 细胞肿瘤常用抗免疫球蛋白的抗体来证实。由于前 B 细胞与浆细胞表面均无免疫蛋白，所以用检测免疫球蛋白的办法就只能证实 B 细胞发育中间时期的肿瘤。目前，已有一系列的 B 细胞表面抗原被发现，而可以证实 B 细胞个体发育的各个时期的肿瘤。

　　对 B 细胞肿瘤最有价值的抗原是 CALLA 。这种抗原仅存在于 B 细胞正常以育期的前 B 细胞、早期 B 细胞以及 80% ～ 90% 的急性淋巴细胞性白血病。因此，抗 CALLA 抗体可以区别淋巴细胞性和髓性白血病。用抗 CALLA 结合其它一些成熟 B 细胞的单克隆抗体，如 CD 19 ， CD 20 ， CD 24 （ B 4 ， B 1 ， BA -1 ）将能证实大部分 B 细胞来源的肿瘤。图 10-16 给出了 B 细胞分化的各个时期细胞膜的表现型。来源于 B 细胞的肿瘤和正常 B 细胞的表现型相似，也就是说， B 细胞前身、成熟 B 细胞及最后分化为分泌 B 细胞 — 浆细胞。　　

图 10-16 B 细胞分化各时期的细胞膜表现型

　　由于 T 淋巴细胞来源的肿瘤浸润性较强，预后较差，并需要多种治疗。 T 细胞肿瘤的表现型千变万化，但大部分均表现 T 细胞抗原 CD 7 （ Leu 9 , 3A ）或其它 T 细胞抗原 CD 2 、 CD 5 （ OKT 11 ， OKT 1 ）。这些抗原与肿瘤的细胞成熟时间有关，因而有助于拟定治疗方案。从 FCM 分析的结果表明，非成熟的 T 细胞肿瘤常表现非成熟的 T 细胞抗原，如 CD 1 和 t 10 。而成熟的 T 细胞肿瘤则仅表现成熟 T 细胞抗原： CD 2 、 CD 3 、 CD 5 和 CD 7 。有时也可表现 CD 2 、 CD 8 ，但不会出现在同一个细胞上面。

　　由于肿瘤细胞的多种来源，很难避免在肿瘤标本中混杂正常细胞，这给 FCM 的分析带来技术上的困难。如残留的红细胞在 FCM 分析时，落入淋巴细胞框定的范围内而造成淋巴细胞各种亚群百分率下降。所以在制备标本时，应尽量想法去除红细胞。另一种污染是正常细胞存在于肿瘤细胞之间，这是一个很头痛的问题。例如骨髓常被外周血污染，反应性的正常淋巴细胞渗入到肿瘤组织中等，因此估计污染程度对解释 FCM 分析的资料有一定的意义。因为在 FCM 分析时，正常细胞与肿瘤细胞可能由于不同的体积和密度而被分开，根据对污染的估计，仔细分析图像就能得到比较正确的结果。

4 ． FCM 对正常 B 细胞和 B 细胞肿瘤分析　　 FCM 对正常 B 细胞和 B 细胞肿瘤的分析在免疫学研究和临床诊断上有着重要的实用价值， B 细胞的某些特征必须使用 FCM 来分析，但是这在 FCM 技术方法中仍存在着一些需要解决的问题。

（ 1 ） B 细胞的标记： B 细胞膜表现免疫球蛋白（ SIg ）存在于所有成熟 B 细胞。最早的 B 细胞前身，细胞质内含有免疫球蛋白 M （ IgM ），但不存在于细胞膜表面。细胞质内 IgM 的证实以及同时测定细胞表面的 SIg ，对 FCM 是很困难的，当然今后可能会用双染法来解决这样的难题。大部分成熟 B 细胞具有 SIgM 和 SIgD ，少量具有 SIgG 和 SIgA ，当然这也可能是因为不同的亚群的缘故。但仅以 Ig 的重链来分类 B 细胞是不可靠的，因为 B 细胞可以从膜表面的 IgM 逐渐转变成 IgG ，因而从重链着手无法把 B 细胞分类。大部分 B 细胞肿瘤也表现出带有 SIgM 和 SigD 。随着 B 细胞逐渐转变成浆细胞，膜表面 Ig 逐渐丧失，在细胞质内又出现大量的免疫球蛋白。

　　与重链相反， B 细胞的整个发生期只有一种 k 或者 λ 轻链， B 细胞肿瘤克隆仅表现一种轻链，因此通过在 FCM 上显示的不平衡的轻链表现可以确定 B 细胞肿瘤。测定方法见（ 3 ）。

　　用 SIg 的最大缺点是它的 “ 嗜细胞性 ” ，因为正常 B 细胞、自然杀伤细胞（ NK ）、激活 T 细胞以及所有巨噬细胞均有 Fc 段受体，因而可以不同程度地与抗 SIg 单克隆抗体的 Fc 段结合而产生非特异性的结果，因此选择抗体时，应使用已被胃蛋白酶消化过的、 Fc 段也被去除的、仅留下来的 F （ ab' ） 2 。

（ 2 ） FCM 测定 B 细胞的临床指证：

① 免疫缺陷；免疫缺陷可以是先天性或获得性的。低丙种球蛋白白血症和无丙种球蛋白白血症常伴有免疫球蛋白分泌的紊乱，因此有必要分析 B 细胞。

② 淋巴瘤：非何杰金氏病的淋巴病， 80% 来源于 B 细胞。因而一旦怀疑为淋巴瘤，就应仔细用 FCM 对 B 细胞的表现型进行分析，可以分析血、骨髓、以及活检淋巴结等。首先确定肿瘤细胞的来源： B 细胞性（ CD 20 + ， SIg + ）或 T 细胞性（ CD 3 + ）。也有可能某些淋巴病来源于单核细胞（ CD 11 + ）成裸细胞而表现出非 T 非 B 。一旦确立为 B 细胞来源后，就应更进一步分析克隆增殖的性质：单克隆、少克隆、或是多克降珠。单克隆性的增殖往往是肿瘤的标志。可以用 SIg 的轻链和重链分别加以测试，往往轻链比重链更有价值。在不久的将来，或许可以直接用免疫球蛋白的基本加以鉴别。

　　对 B 细胞亚群的确定，目前并未定论，但某些 B 细胞被 CD 5 （ T 1 ， OKT 1 ）染色。正常 B 细胞中这些细胞较少，而多见于慢性淋巴性白血病和骨髓移植后的免疫缺陷时期。在 B 细胞的肿瘤病人中， 10% 的也可以出现 CD 20 （ B 1 ）阴性反应，这是 B 细胞成熟而将分化为浆细胞的标志。在异常 B 细胞上，往往有一些 B 细胞的标记缺失或其它表现型出现，因而对异常 B 细胞的 FCM 的分析尤为重要。图 10-17 显示 CD 19 —FITc （ B 细胞）和 CD 5 -PE （ T 细胞）双染色的假三维图像分析。 X 轴为绿色荧光的 Leu 12 (B 细胞 ) ， Y 轴为红色荧光的 PE—Leu 1 (T 细胞 ) 。从图中可见，有较多的细胞表现出 Leu 12 + t Leu 1 + , 阴性区内为 NK 细胞和红细胞等。 　　

图 10-17 　异常 B 细胞双染色的假三维图

（ 3 ） k-λ 测定 B 细胞克隆： k 、 λ 测定法是一种从正常 B 细胞中测定少量 B 细胞克隆生长的方法。其基本原理是：若有 B 细胞克隆存在，将改变某一种轻链（ k 或 λ ）的荧光强度的分布。若轻链为 k 的 B 细胞生长，则抗 k 的抗体能测试出这种变化，而抗 λ 的抗体的测试没有任何改变。正常情况下， B 细胞的 k 和 λ 的荧光强度分布是一致的（见图 10-18 ）

图 10-18 k-λ 克隆的测定

　　正常情况， B 细胞轻链分布图像，一致 κ 和 λ 的波形没有区别。但在异常时，若有单克隆生长， κ 链有分布则与 λ 不一致，在总和的曲线形态上也会产生差异。

　　在实际应用中，血液、体液、组织细胞的悬浮液效果均较好，而对于骨髓，大量细胞的非特异性标记会影响测定的结果。这里面必须强调，正常 B 细胞中的克隆细胞生长并不意味着它们必然是肿瘤细胞，还必须结合其它指标再做结论。不过这种方法对确定肿瘤细胞的存在、细胞发育阶段、以及经治疗后病情控制的状况等，都可以提供一些有用的资料。

　　以上仅限于从外周血的白细胞分析这一侧面介绍了 FCM 的某些疾病中的临床应用。其实，它也仅只是问题的一个部分。例如，有研究工作表明： CD 34 抗原在由红系、巨核系、粒系和巨噬细胞三个细胞成株单元组成的成株细胞中有所表现。 CD 34 + 细胞在人的骨髓细胞中约占 1 ～ 4% ，而在外周血中却探测不到。又如， NK 细胞近来被认为可能和人类的某些疾病的发病机理有关，对 NK 细胞的测量可以作为免疫治疗的免疫监测的重要参数和有效的预后征状的指示。以前是用放射性的 51 Cr 的释放来检测 NK 敏感的靶细胞的毒理学活性从而评估 NK 的功能的，而采用荧光探针 CFDA （ car － boxy—fluorescein diacetate ）标记则可用 FCM 技术更为安全可靠地进行测定。有报告指出，健康男人的数值为（ 67.1±22.7% ） % ，健康女人为（ 63.9±20.0% ）；患有妇科癌肿病人则为（ 38.5±23.1 ） %, 明显偏低。这些工作表明， FCM 的技术从免疫组织化学角度还会有所发展。在第二节　我们曾简单介绍了流式细胞分析技术在生物医学工程中应用的一些技术途径，这也可以启发我们借助于 FCM 来提高免疫组织化学的分析能力。可以预见， FCM 一定会成为免疫组织化学的一项重要的技术工具，并将在医学科研和临床应用中发挥更大的作用。

　　附【美国 Becton –Dickinson 公司可提供的 FCM 标准】荧光微球（ Fluorescent beads ）；鸡红细胞核（ Chicken erythrocyte nu － clei ）和小牛胸腺细胞核（ Calf thymocyte nuclei ），用于 DNA 测量的质量控制；单克隆抗体试剂；以及用于免疫表型（ immunopheno － typing ）和其它临床应用的药盒。

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