若用单指标直方图，对 PBMC 而言，可以把淋巴细胞和单核细胞分开。见图 10-10 中的 A 、 B 图。但对红细胞溶解后的全血，单指标图分辨率则不够了（图 10-10 的 C 、 D 图），图 A 、 B 给出的是经 ficoll 后的 PBMC ；图 C 、 D 给出的是人外周血白细胞。图中数字编号所代表的组分和图 10-9 相同。
由上可见，在分析红细胞溶解后的全血时，必须先采用双指标二维点图。从图上也可清楚地看出，粒细胞、未被溶解的红细胞和一些渣滓，由于不同的体积和致密度，明显地区别于淋巴细胞和单核细胞从而能把它们分开。看到清楚的细胞分群以后，可以在计算机的显示屏上将所要分析的细胞画线框出，并通过指令送入存贮器，以后就可只对框出部分做各种数据分析和深入考查。图 10-11 就是对双指标点图上的淋巴细胞群框定的示意图。数字所表示的意思和图 10-9 相同。
图 10-10 外周血白细胞及 PBMC 的单指标直方图
图 10-11 双指标点图上细胞的框定
2 ．单维直方图上阴性分界游标设置前面已经强调，在用 FCM 分析时，阴性对照是必不可少的。首先用非染色细胞，根据前面介绍的双指标二维点图的办法，将某一细胞群框定；然后分别选用绿色荧光（ GFL ）和红色荧光（ RFL ）单指标直方图。在直方图上所出现的细胞均为阳性。可用改变 GFL 和 RFL 增益的办法，将细胞恰好调节 到左侧并设立游标（图 10-12 ）。
然后再测试 MsIg 染色的阴性对照。某些细胞，由于膜上的 Fc 受体可以与对照抗体鼠 Ig 非特异性结合，因而有一定的背景染色，不过这种阳性百分率不应超过 5% 。所以 MsIg 与非染色细胞的分界游标确立后，以后所测试的标本以此为标准，游标位置基本不变。
图 10-12 阴阳性细胞分界游标的设置
MsIg 的红、绿荧光阴阳性分界游标确立以后，可以测试实验标本。首先检查细胞分群情况，然后检查淋巴细胞群是否落在已输入计算机的淋巴细胞框定的范围里。若染色及 FCM 的工作性能都正常，则框定的位置不会改变。然后转换成荧光直方图。若为 FITC 标记的细胞，则 GFL 为 X 轴；若为 PE 标记的细胞，则用 RFL 为 X 轴。由于阴阳性分界游标记已确立，细胞阳性率及图像均显示于计算机荧光屏上；同时也可选用其它指标和图像、打印所需的资料等。
3 ．双染色分析游标设立和荧光校正
（ 1 ）游标的设立：游标设立的原理和单染并无不同，但具体要用二维点图和二维等高图来完成。分别选用 GFL 和 RFL 为 X 和 Y 轴。先用不染色细胞测试，将阴性细胞集中在左下角（图 10-13 ）。分别为 X 、 Y 轴设立游标，再用 MsIg 的阴性对照测试。可将 X 、 Y 轴游标略为移动，使位于窗 “3” 内的细胞（阴性）在 95% 以上。
（ 2 ）红、绿荧光的校正：由于红色荧光探测器在最佳测试状态时，会让部分绿色荧光进入红色荧光探测器。这是因为一部分细胞发出的绿色荧光波长较长。若用阻断或滤色的办法消除进入红荧光探测器的这部分 GRL ，就会大大地降低 RFL 探测器的灵敏度。因而只好在操作时，通过电子计算机预先进入荧光校正，在 RFL 中适当扣除 GRL 的影响。
通常红色荧光进入绿色荧光探测器的情况比较光见，图 10-14 给出 CD 11 -PE （ T 细胞、 RFL ）及 CD 8 -FITC （ T 抑制细胞， GFL ）双染细胞在二维等高图上进行荧光校正的示意图。 X 轴为 GFL ， Y 轴为 RFL ，由 X 轴 Y 轴游标划分的四个窗的阴阳性和图 10-13 相同。各窗给出的百分数为该细胞群所占百分比。图 A 表示未经校正时的情形。窗 “2” 内 31.46% 表示双阳性细胞，即在 T 细胞中 31.46% 为抑制细胞毒细胞。经过适当校正，可见有两群阳性双标记细胞出现（ B 图）。高强度部分为真正的 CD 8 、 CD 11 双标记阳性细胞；低强度部分属于 CD 8 绿色阳性细胞（ NK 细胞）。此时 “2” 窗中细胞份额减为 7.59% 。需要指出的是校正过度则会使各区的阳性细胞都减少（图 C ）。
图 10-13 双染色二维点图上游标的设置
1 区：红色荧光阳性； 2 区 ：红、绿荧光均为阳性； 3 区：阴性细胞： 4 区：绿色荧光阳性细胞
图 10-14 双染色在二维等高图上荧光校正
双染色的荧光校正是用电子补偿电路来完成的。补偿时先测定一种染料的荧光，此时除了应该接收该荧光的光电倍增管 PMT 1 有信号输出外，另一光电倍增管 PMT 2 也常会有微弱输出。调节 补偿器使 PMT 2 的输出为 0 ；然后再测另一种波长的荧光染料，调 PMT １ 的补偿器使之输出也为 0 ；然后再测另一种波长的荧光的染料，调 PMT 1 的补偿器使之输出也为 0 ：如此反复调节 ，使两种荧光的探测器都获得补偿。实际调节 时用的是一种标准荧光微球，微球上标有已知数量的荧光分子。利用不同的微球可调整、补偿不同荧光的测量通道。需要指出的是：当 PMT 高压有所改变、激光和滤片系统有所变动时，都要对荧光校正做重新补偿调节 。
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