FCM对外周白细胞的免疫荧光分析（二）

（2）红细胞被溶解后再对白细胞染色：此方法的优点是可以了解被染白细胞的数量以及存活率。但由于有时有些标本比较敏感，溶解红细胞后，还要经过多个染色步骤，这样容易造成抗原的丧失。此法具体步骤如下：

①室温下放入14ml氯化铵在15ml的试管里。

②加入0.5～1ml全血，混合3～5min。

③立即离心100～150×g，并用PBS洗2次。

④白细胞计数，注意存活率应在90%以上。做成每毫升含5×10 6 白细胞悬浮液。将细胞分配到5ml的试管，每试管0.2ml，即1×10 6 个细胞。

⑤荧光标记的单克隆抗体染色30min，4 ℃ ，避光。抗体浓度配制如前所述。

⑥PBS洗3次后，用0.5%甲醛固定。方法如前。

（3）用Ficoll—Hypaque 梯度离心法分离出单个核细胞：用此法可以分离骨髓细胞、淋巴结、扁桃体捣碎后的单细胞悬液等。血液标本应有抗凝剂。取血到分离不能超过6h。

①抗凝全血4～20ml，用等量PBS或Hanks液稀释。

②稀释血8或40ml置于15或50ml离心管内，4或10ml Ficoll—Hypaque（或者等量的其它分离液，比重为1.007）从离心管底部轻轻加入到血的下面。这种方法对血的扰动较小，比将全血加到Ficoll上面为好。加完后，可以清楚看到Ficoll与全血之间有一明显的分界线。注意在Ficoll快加完时应特别小心，否则有可能加入气泡搅混血样，使血与分离液混合，达不到分离的目的。

③离心350～400g,30min。红细胞、粒细胞以及死细胞将位于离心管底部，中间层的单个核细胞为淋巴细胞、单核细胞和一些血小板。

④取出中间层中所有细胞，若在Ficoll中还有细胞也要取出，这也是单个核细胞（PBMC）。

⑤用PBS洗3次，第1次清洗时，可用较快速400×g离心10min。因为有可能中间层中混有一些ficoll，比重增加而细胞不易沉降。

⑥PBMC计数，注意存活率应高于90%。配成5×10 6 个/ml的细胞悬浮液。

⑦取出0.2ml的悬浮液加入到5ml试管（内含1×10 6 细胞），用荧光标记的单克隆抗体染色，方法如前。洗3次后固定。注意必须先染色后固定，固定后的细胞膜通透性改变，会导致荧光标记的抗体进入细胞中去，而在显微镜下观察的染色效果则和死细胞一样。当用FCM分析时，则均为阳性而达不到检验目的。这也是用FCM分析的细胞存活率应高于90%的原因。

（4）荧光标记抗体的细胞染色：如前所述，FCM分析被荧光标记的抗体染色的细胞，在选择荧光染料时必须注意这些荧光染料所需要的激发光波长是否与所使用的FCM的激发光谱相匹配。一般各个公司所采用的绿色荧光染料为FITC，而选用的红色荧光染料却不尽相同，有的用TRITC，有的用藻红蛋白（PE），所需要的激发光谱就不一样，因而若因匹配不当则会招致荧光抗体所染的细胞分析不出来，这是应该注意的。

　　这里的标本染色方法和免疫荧光法相同。下面仅说明一些具体的注意事项：

①在用间接法染色时，染色步骤依次为第一抗体→清洗→第二抗体→清洗→红细胞溶解。为了实验的方便，将第二抗体也配成每次实验用10μl。

②双色法：双色法多用于直接染色法。将分别用FITC和PE标记的抗体各10μl置入同一个含有约1×10 6 /0.2ml的试管内，30min，4℃避光。然后清洗、固定。

　　目前不少制备单克隆抗体的公司已将比值有意义的两种抗体，分别用红、绿荧光染料标记后，制成一种试剂。如CD 2 —FITC/CD 20 —PE；CD 4 -FITC/CD 8 -PE等。可按说明使用，具体用量为每次实验10μl。

③对照组：众所周知，免疫组化的染色过程中，阴性和阳性对照是必不可少的。在准备用FCM分析的细胞时，对照标本的制备显得格外重要。因为一次用FCM分析的样品可能会很多，甚至多达上百个试管。对同一病人也可能会用到20～30个不同的单克隆抗体。每一个病人都要有相应的阴性对照。阴性对照主要用于仪器分析细胞之前，设立阴性和阳性的分界线。阳性对照主要用于检查染色方法。阳性对照细胞选自那些已知的细胞和已知的单克隆抗体中的阳性反应最明显者。阴性对照细胞有以下几种：

1）非染色细胞：直接染色法时，用10μl PBS代替与荧光结合的单克隆抗体，其它步骤相同。间接染色法时，分别用10μl的PBS代替第一抗体和荧光第二抗体，其它步骤相同。

2）使用非特异性的抗小鼠膜表面免疫球蛋白（MsIg），代替特异性的单克隆抗体。这是由于所使用的单克隆抗体来自小鼠，可能造成非特异性的假性反应，因此使用MsIg作为对照。同时还需要注意选择与实验用单克隆抗体亚类一致的MsIg。如大部分单克隆抗体为IgG1，也有部分抗体为IgM，所以用MsIg作对照组时，往往使用MsIgG和MsIgM两种。直接染色法时，用10μl与荧光结合的MsIg，代替荧光单克隆抗体。间接染色时，用10μl无荧光的MsIg代替第一抗体。其它步骤与实验组相同。

3）双染色对照：将各10μl 的分别与红荧光染料和绿荧光染料结合的MsIgg 或MsIgM，加入到同一个试管，代替荧光的特异性单克隆抗体，其它步骤相同。

4）间接法对照：用10μl的PBS代替第一抗体。荧光第二抗体的浓度和使用量均与其它实验相同，其它实验步骤也和实验组相同。

二、白细胞免疫荧光分析的数据分析

　　在仪器调试和校准及标本制备完毕之后，就要做测试和数据分析工作。这里先讨论一下有关数据测量和分析的技术问题，而一些医学应用的具体参数的测量和分析后面做介绍。

　　1.0 。 散射和90 。 散射的双指标的二维图像分析　　可以把0 。 和90 。 散射分别选作二维图像的X轴和Y轴指标。通过图中数据点分布把全血分为淋巴细胞、单核细胞和粒细胞几个亚群（图10-9）。

图中， A 、 B 图的淋巴细胞数大约有 6000 ～ 9000 个； C 、 D 图约有 2000 ～ 4000 个。分群编号依次表示： ① 红细胞、死细胞和渣滓； ② 淋巴细胞群； ③ 大颗粒淋巴细胞； ④ 单核细胞； ⑤ 粒细胞。数据是对 1000 个细胞分析得到的。