普通的PCR反应体系中，加入的核苷酸单体为4种2′-脱氧核苷三磷酸(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)。测序反应体系中，加入的核苷酸单体为2',3双脱氧核苷三磷酸( ddNTP)。与dNTP相比，ddNTP在脱氧核糖的位置上缺少个羟基，反应过程中虽然可以在DNA聚合酶作用下，通过其磷酸基团与正在延伸的DNA链的末端脱氧核糖-OH发生反应，形成磷酸二酯键而掺入到DNA链中，但它们本身没有-OH，不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，从而使正在延伸的DNA链在此终止。
根据这一原理分别设计四个反应体系，每一反应体系中存在相同的DNA模板、引物、四种dNTP和一种ddNTP(如ddATP)，则新合成的DNA链在可能掺入正常dNTP的位置都有可能掺入ddNTP，导致新合成链在不同的位置终止。由于存在ddNTP与dNTP的竞争，生成的反应产物是一系列长度不同的多核苷酸片段。
将制得的四组混合物全部平行地点加在电泳板上进行电泳，每组制品中的各个组分将按其链长的不同得到分离，从而制得相应的放射性自显影图谱。从所得图谱即可直接读得DNA的碱基序列
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