基因是位于DNA上的,其测序的原理是一样的
DNA测序的方法有很多种.
目前最常见的是双脱氧终止法了.
在测序用的缓冲液中含有四种dNTP及聚合酶.
测序时分成四个反应,
每个反应除上述成分外分别加入2,3-双脱氧的A,
C,
G,
T核苷三磷酸(称为ddATP,
ddCTP,
ddGTP,
ddTTP),
然后进行聚合反应.
在第一个反应物中,
ddATP会随机地代替dATP参加反应一旦ddATP加入了新合成的DNA链,
由于其3位的羟基变成了氢,
所以不能继续延伸.
所以第一个反应中所产生的DNA链都是到A就终止了;
同理第二个反应产生的都是以C结尾的;
第三个反应的都以G结尾,
第四个反应的都以T结尾,
电泳后就可以读出序列了.
也许这样说你不一定明白.
举一个例子,
假如有一个DNA,
互补序列是GATCCGAT,
我们试着做一下:
在第一个反应中由于含有dNTP+ddATP,
所以遇到G,
T,
C三个碱基时没什么问题,
但遇到A时,
掺入的可能是dATP或ddATP,
比如已合成到G,
下一个如果参与反应的是ddATP则终止,
产生一个仅有2个核苷酸的序列:
GA,
否则继续延伸,
可以产生序列GATCCG,
又到了下一个A了.
同样有两种情况,
如果是ddATP掺入,
则产生的序列是GATCCGA,
延伸终止,
否则可以继续延伸,
产生GATCCGAT.
所以在第一个反应系统中产生的都是以A结尾的片段:
GA,
GATCCGA,
同理在第二个反应中产生的都是以C结尾的片段:
GATC,
GATCC,
在第三个反应中产生的都是以G结尾的片段:
G,
GATCCG
在第四个反应中产生的都是以T结尾的片段:
GAT,
GATCCGAT,
电泳时按分子量大小排列,
A反应的片段长度为2,
7;
C反应的为4,
5;
G反应的为1,
6;
T反应的为3,
8,
四个反应的产物分别电泳,
结果为
8
7
6
5
4
3
2
1
A
|
|
C
|
|
G
|
|
T
|
|
我们可以从右向左读,
为GATCCGAT,
至此,
测序完成
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