基因芯片技术在疟疾研究中的应用

随着人类基因组( human genome p roject, HGP) 、多种模式生物(model organism)和部分病原体基因组测序的完成,基因序列数据以前所未有的速度不断增长。传统实验方法已无法系统地获得和诠释日益庞大的基因序列信息,研究者们迫切需要一种新的手段,以便大规模、高通量地研究众多基因在各种生理、病理状态下的多态性及其表达变化,从而揭示它们的功能、相互作用和调控关系。在此背景下, 20世纪80年代末基因芯片( gene chip)技术应运而生,它利用微电子、微机械、生物化学、分子生物学、新型材料、计算机和统计学等多学科的先进技术,实现了在生命科学研究中样品处理、检测和分析过程的连续化、集成化和微型化。近年,基因芯片技术在疾病易感基因发现、疾病分子水平诊断、基因功能确认、多靶位同步超高通量药物筛选以及病原体检测等医学与生物学领域得到广泛应用 。

    疟疾是一种经按蚊传播、由疟原虫感染所致的寄生虫病,在世界范围内流行形势严峻, 2005年全球有100多万人死于该病 。目前,疟疾诊断、治疗及疫苗等领域研究已深入到分子水平。2002 年恶性疟原虫和冈比亚按蚊基因组草图绘制完成,随之疟疾研究的重心开始转向功能基因组学研究,基因芯片技术在新形势下的疟疾研究中发挥着越来越重要的作用。现就基因芯片基本原理及其在疟疾研究中的应用综述如下。

1 基因芯片技术的基本原理
    基因芯片又称DNA芯片(DNA chip )或DNA微阵列(DNA microarray)。其原理是采用光导原位合成或显微印刷等方法将大量特定序列的探针分子密集、有序地固定于经过相应处理的硅片、玻片、硝酸纤维素膜等载体上,然后加入标记的待测样品,进行多元杂交,通过杂交信号的强弱及分布,来分析目的分子的有无、数量及序列,从而获得受检样品的遗传信息 。其工作原理与经典的核酸分子杂交如Southern和Northern印迹杂交一致,都是应用已知核酸序列与互补的靶序列杂交,根据杂交信号进行定性与定量分析。经典杂交方法固定的是靶序列,而基因芯片技术固定的是已知探针,因此基因芯片可被理解为一种反向杂交。基因芯片能够同时平行分析数万个基因,进行高通量筛选与检测分析,解决了传统核酸印迹杂交技术操作复杂、自动化程度低、检测目的分子数量少等不足。根据所用探针类型,基因芯片可分为cDNA ( comp lement DNA)芯片和寡核苷酸芯片;根据检测目的又可分为表达谱芯片和单核苷酸多态性( single nucleotide polymorphisms, SNP)芯片。随着芯片技术在其他生命科学领域的延伸,基因芯片概念已泛化到生物芯片,包括基因芯片、蛋白质芯片、糖芯片、细胞芯片、流式芯片、组织芯片和芯片实验室( laboratory on a chip)等。

    芯片基片可用材料有玻片、硅片、瓷片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜和尼龙膜,其中以玻片最为常用。为保证探针稳定固定于载体表面,需要对载体表面进行多聚赖氨酸修饰、醛基修饰、氨基修饰、巯基修饰、琼脂糖包被或丙烯酰胺硅烷化,使载体形成具有生物特异性的亲和表面。最后将制备好的探针固定到活化基片上,目前有两种方法:原位合成和合成后微点样 。根据芯片所使用的标记物不同,相应信号检测方法有放射性核素法、生物素法和荧光染料法,在以玻片为载体的芯片上目前普遍采用荧光法。相应荧光检测装置有激光共聚焦显微镜、电荷偶合器( charge coup led devices, CCD)、激光扫描荧光显微镜和激光共聚焦扫描仪等。其中的激光共聚焦扫描仪已发展为基因芯片的配套检测系统 。经过芯片扫描提取杂交信号之后,在数据分析之前,首先要扣除背景信号,进行数据检查、标化和校正,消除不同实验系统的误差。对于简单的检测或科学实验,因所需分析基因数量少,故直接观察即可得出结论。若涉及大量基因尤其是进行表达谱分析时,就需要借助专门的分析软件,运用统计学和生物信息学知识进行深入、系统的分析,如主成分分析、分层聚类分析、判别分析和调控网络分析等 。芯片数据分析结束并不表示芯片实验的完成,由于基因芯片获取的信息量大,要对呈数量级增长的实验数据进行有效管理,需要建立起通行的数据储存和交流平台,将各实验室获得的实验结果集中起来形成共享的基因芯片数据库,以便于数据的交流及结果的评估。

2 基因芯片技术在疟疾研究中的应用
2. 1  基因芯片技术在疟原虫研究中的应用
    基因芯片技术的出现有力地促进了人们对疟原虫生物学的认识。早在2000年,恶性疟原虫的基因组测序尚未完成, Hayward等根据恶性疟原虫绿豆核酸酶基因文库, 制成“鸟枪”DNA ( shotgun DNA)芯片,分析了疟原虫滋养体和配子体之间的基因表达差异,为疟原虫发育阻断剂和疫苗研究提供了有益线索。恶性疟原虫全基因组测序完成后,疟原虫高通量表达谱芯片的应用得到进一步推广。为阐明疟原虫发育的分子调节机制,多位研究者以cDNA或寡核苷酸为探针制成芯片,比较分析疟原虫不同发育周期的基因表达变化。如Le Roch等比较了恶性疟原虫红细胞内各发育阶段2号染色体上转录组的差异。Ben Mamoun 和Isokpehi 等研究了恶性疟原虫红细胞内各发育阶段的基因表达变化。Bozdech等分析了恶性疟原虫裂殖子与滋养体表达谱的差异。Young等则观察了恶性疟原虫配子体Ⅰ～Ⅳ期转录组的变化。此外,Vontas等还利用芯片技术分析了伯氏疟原虫动合子及其早期卵囊体外培养的基因表达差异。
    基因芯片技术也可用于比较不同种或同种不同株疟原虫的基因表达差异, Ganesan等利用芯片研究了恶性疟原虫Dd2 和HB3 株基因表达差异。Hall等比较了伯氏、夏氏、约氏和恶性疟原虫的基因表达差异。Gissot等利用芯片技术分析了红内期不同时点恶性疟原虫3D7株及F12株之间表达谱的差异,并发现了影响配子体生成的候选基因。近年,基因芯片在疟原虫研究中的应用范围进一步拓宽,研究内容涵盖疟原虫新基因发现 、疫苗靶标筛选 、转录因子调控网络、疟原虫适应人体宿主机制、疟原虫比较基因组杂交分析 、恶性疟原虫抗原变异分子机制以及疟原虫攻击红细胞机制等。总之基因芯片技术正逐步成为疟原虫分子生物学研究的有力工具。
2. 2　基因芯片技术在传疟按蚊研究中的应用
    基因芯片在按蚊研究中最先用于探讨按蚊对原虫的抗性机制,在2003年, Kumar等利用基因芯片比较了对疟原虫易感和抗性的冈比亚按蚊基因表达的差异,发现冈比亚按蚊对疟原虫的抗性与活性氧( reactive oxygen species, ROS)的产生和代谢关系密切。
    按蚊对杀虫剂的抗性问题日益突出,给疟疾的预防和控制带来困难,芯片技术的出现为人们认识按蚊杀虫剂抗性的产生机制提供了新手段。2005年David和Vontas等设计出冈比亚按蚊基因芯片,比较了杀虫剂敏感按蚊与抗性按蚊中230个杀虫剂代谢相关基因的表达情况,结果发现谷胱甘肽S转移酶( glutathione-S-transferase, GST) 、细胞色素314A1 (CYP314A1) 、细胞色素P450 s等基因与滴滴涕( dichloro-diphenyl-trichloroethane, DDT)抗性有关,拟除虫菊酯抗性按蚊的P450、CYP325A3基因表达上调。2005年Dana和Marinotti 等分别借助cDNA和表达序列标签( exp ressed sequence tag,EST)芯片,观察血餐前后不同时间点冈比亚按蚊基因表达的变化,探讨了按蚊对血细胞的消化、免疫反应以及卵的形成和运动的分子机制。2006 年Dissanayake和Strode等利用基因芯片技术比较了冈比亚按蚊不同发育阶段和不同组织的基因表达谱差异,发现约1 /4基因的表达受发育调节。
    此外,另有研究者分别利用基因芯片研究了按蚊与原虫之间的相互作用机制 、按蚊基因调控网络 、按蚊唾液腺转录本 、按蚊对原虫的免疫应答等。总之,基因芯片技术的应用已显著拓宽和提高了传疟按蚊的研究领域和研究水平。
2. 3　基因芯片技术在疟疾动物模型研究中的应用
    动物模型在人类疟疾的病理学研究、疫苗开发和治疗试验等方面发挥着不可替代的作用,基因芯片技术与动物模型的结合,更进一步加深了人类在分子水平上对疟疾的认识。2004年Sexton等利用基因芯片分析了鼠疟原虫转录组的变化,结果发现鼠感染原虫后脑部400余基因及脾脏600余基因的转录发生了变化,这些变化反映了鼠红细胞生成抑制、糖酵解和干扰素介导的免疫应答增强,从而找到疟疾导致中枢神经系统症状、贫血和乳酸增多症的可能机制。2005年Sarfo等利用cDNA芯片分析了趋化因子及其受体在约氏疟原虫感染小鼠脑部的表达情况,结果发现趋化因子RANTES ( regulated on activation, normal T cell exp ressed and secreted)及其相应受体CCR1、CCR3和CCR5的mRNA在感染小鼠的脑部表达上调,参与了小鼠小脑的炎症介导、细胞降解和超微结构改变。2006年Delahaye等利用cDNA芯片比较了脑型疟易感型与抵抗型小鼠脑部的基因表达差异,分析确定了可能与小鼠脑型疟易感性有关的31个候选基因。
    为探讨病原体间的免疫协同作用, 2005年Page等利用芯片分析了结核分支杆菌与约氏疟原虫混合感染及单独感染时小鼠脾脏细胞的Ⅰ型免疫应答情况,发现混合感染组小鼠脾脏细胞γ干扰素( interferon gamma, IFN2γ)和肿瘤坏死因子α ( tumor necrosis factor alpha, TNF2α)的生成水平显著高于单独感染组。结论认为结核分支杆菌可以增强Ⅰ型免疫应答来保护小鼠免受致死性鼠疟损伤。2006 年有研究者利用cDNA芯片分析了恶性疟原虫红细胞膜蛋白Ⅰα(CDCRⅠα)的活化对人类基因表达的影响,结果提示CDCRⅠα可以激活多条免疫途径,促进B 细胞多克隆活化和凋亡延迟。从而找出了疟疾流行区Burkitt ’s 淋巴瘤危险性增加的潜在原因。

3 问题与展望
    目前,基因芯片技术在疟疾相关研究中的应用尚处于起步阶段,但已显示出巨大的潜力和良好的前景,然而在实践中还存在一些困难和问题,主要有: (1)研究成本较高,由于芯片制作和检测需专门的仪器设备,一般实验室难以承担其高昂的费用,无法独立开展研究; ( 2)方法标准化不足,由于各实验室设备和处理方法等因素的不同,众多数据间常不具备可比性,不利于芯片数据共享; (3)配套软件不够完善,现有基因芯片检测软件和生物信息学分析软件尚不能充分满足芯片检测结果的读取、分析、挖掘和解释; (4)研究领域有待拓宽,以往疟疾基因芯片研究主要集中在表达谱分析上, SNP相关研究较少,而SNP芯片技术已日趋成熟,并在众多生命科学领域取得成功,因此有必要重视和推进SNP芯片在疟疾研究中的应用; ( 5)基因序列信息有限, 基因芯片研究需要大量已知准确的DNA、cDNA或EST序列信息,但目前间日疟原虫和多种按蚊的全基因组测序工作尚未完成。
    虽然基因芯片技术还存在诸多问题,但其在疟原虫、传疟按蚊和疟疾动物模型等研究领域中已显示出特有优势。随着微电子、微机械等技术上的突破以及生物化学、分子生物学和生物统计学等学科的发展,基因芯片在疟疾研究中必将具有更为广阔的发展空间。近年,疟原虫对抗疟药的抗性形势日趋严峻,现场和实验室研究发现多个基因可作为疟原虫抗性分子标志,但传统检测方法耗时、耗力,限制了抗性分子标志在现场中的应用;而芯片技术具有高速度、高通量的优势,因此构建基于寡核苷酸探针的抗性基因检测芯片显得十分必要。此外,基因芯片技术还有待应用于抗疟药的筛选、疟疾快速诊断、疫苗靶标寻找、疟原虫致病机制研究、虫株分型鉴定、按蚊对杀虫剂抗性机制探讨等领域。基因芯片技术与其他技术的联合应用,还将有助于从基因、转录、表型多水平理解疟疾的传播和发病机制。甚至,最终可以通过芯片技术实现疟疾基因水平研究全过程的集成化和自动化,即疟疾芯片实验室 。不难预见,基因芯片技术的不断完善和发展,将使其在疟疾研究中得到更为广泛的应用,并有力促进疟疾诊断、治疗和预防控制水平的提高。