MALDI-TOF MS在临床微生物样本直接检测中的应用（二）

三、MALDI-TOF MS在临床样本直接检测中的应用

从临床样本直接检测微生物可以节省转种培养的时间。目前已取得显著进展的是从血培养阳性样本中直接检测细菌和酵母样真菌, 而从中段尿和其他无菌体液样本中的直接检测也在快速发展。

(一)血流感染病原菌的快速检测

血流感染的发病率和死亡率都相当高, 快速准确的血流感染病原菌鉴定对于临床抗菌药物的合理使用和病愈率的提高至关重要。直接检测能显著减少鉴定时间(< 29 h), 使得在血培养阳性的第1个24 h内接受适当抗菌药物治疗的患者增加11%[14]。CLERC等[15]认为基于MALDI-TOF MS 对血培养阳性样本的检测可能会成为血培养阳性患者管理中除了革兰染色报告之外的第2个关键步骤。近年来, 有不少的研究应用MALDI-TOF MS直接鉴定临床微生物样本, 取得明显进展的是从血培养阳性样本中直接鉴定细菌和酵母样真菌[5, 10, 16], 而混合菌和厌氧菌等的鉴定还有待更多的研究。

1.鉴定效能 (1)细菌:在引起血流感染常见菌的鉴定方面, MALDI-TOF MS技术已经在肠杆菌科细菌、葡萄球菌等病原菌的直接鉴定方面取得了很好的鉴定结果。大量的研究评估了MALDI-TOF MS用于直接鉴定阳性血培养瓶的表现, 不同文献报道的种水平的鉴定率在54%~99%不等[5, 10, 11, 17, 18, 19], 主要是由于所鉴定细菌种类/数量的不同, 或是运用了不同的预处理/提取方法, 或是定义了不同的cut-off值。SCHMIDT等[19]、SCHUBERT等[20]应用不同的操作程序直接鉴定阳性血培养瓶样本, 结果显示103株代表临床最常见的13个属24个种的样本中, MALDI-TOF MS准确鉴定其中的72%(86.6%革兰阴性菌, 60.0%革兰阳性菌); 500例样本中, 其中革兰阳性菌358例, 革兰阴性菌98例, 总体种的鉴定率达到了86.5%, 其中革兰阳性菌是89.8%, 革兰阴性菌是86.3%。国内最新的研究也显示, 陈峰等[21]运用分离胶促凝管联合MALDI-TOF MS直接检测, 革兰阴性菌和革兰阳性菌中有84.0%和75.0%能被准确鉴定到种的水平; 对于血流感染中最常见的病原菌的菌种鉴定符合率达到83.3%~96.9%。以上研究均显示了MALDI-TOF MS在血流感染直接鉴定方面的良好表现, 并呈现出了如下特点:对革兰阴性菌的鉴定率比革兰阳性菌高; 无荚膜的细菌较有荚膜的细菌(细胞壁难以破坏提取到足够的菌体蛋白)的鉴定率高; 混合细菌感染时鉴定能力有限, 多数情况下只能鉴定出其中一种优势细菌; 对草绿色链球菌的鉴定效果较差(鉴定不出, 或将缓症链球菌鉴定为肺炎链球菌)[10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20], 需要进行另外的确证试验; (2)真菌:MALDI-TOF MS在鉴定酵母菌方面有较高的鉴定率。FERRONI等[18]、YAN等[16]的研究表明酵母菌鉴定的正确率可达91%~100%。但是也有学者得到了相反的结果, GORTON等[13]和PAOLUCCI等[22]直接鉴定的正确率只有56%和41%, 可能是因为鉴定使用的血量过少(1.5 mL), 或是在处理样本的过程中样本的丢失导致了低鉴定率; (3)其它细菌:目前关于厌氧菌的直接鉴定的报道较少, 并且显示了鉴定成功率并不理想, 可能是因为厌氧菌对生长条件的要求较为苛刻, 导致增菌的数量达不到要求, 还需要更多的研究来优化其鉴定条件。

2.不同的检测方法 上述结果均是MALDI-TOF MS直接检测报阳血培养瓶的样本所得到的。有研究表明报阳血培养瓶的样本也可以转种到固体培养基上进行短暂孵育(如2~4 h)后再进行鉴定, 则具有更大的优势。KROUMOVA等[23]在质谱法分析实施蛋白提取程序之前, 将样本富集到一个增菌培养基中孵育大约2 h后再进行质谱分析, 同时达到增菌和减少血液成分干扰的目的, 提升了鉴定分数, 使鉴定结果更可信; IDELEVICH等[24]将血培养阳性的样本转种到血平板孵育1.5、2、3、4、5、6、7、8、12和 24 h(对照), 分别直接进行MALDI-TOF MS检测, 直到有可靠的到种水平的鉴定结果出现(鉴定分数≥ 2.0), 结果发现革兰阳性球菌平均鉴定到种所需要的孵育时间是5.9 h, 革兰阴性杆菌平均鉴定到种所需要的孵育时间是2 h。如果增加了蛋白提取程序, 革兰阳性球菌的孵育时间将缩短至3.1 h, 但对革兰阴性杆菌的影响不明显。这种方法可以有效地减少额外的人工操作时间和费用。HONG等[25]的研究也表明, 这种方法能得到可靠的鉴定结果(与传统生化方法的属水平的一致率是98.9%), 并且这种方法不会受血培养系统的影响, 成本低, 易于操作。

3.与药物敏感性联合检测 为了克服MALDI-TOF MS不能做体外药物敏感性试验的不足, MALDI-TOF MS已经开始与药物敏感性试验联合用来直接检测阳性血培养瓶的样本[26], 用不含活性炭的血培养基在过滤和洗涤之前用溶解细胞的缓冲液进行孵育, 然后将从过滤膜上收集的微生物直接进行MALDI-TOF MS分析, 剩下的样本用VITEK 2系统孵育并进行药物敏感性试验, 将94.0%的样本鉴定到了种的水平, 药物敏感性试验与传统方法相比有93.5%的一致率, 并且相较于传统的56.3 h, 新方法鉴定和药物敏感性试验所用的时间缩短到了11.4 h。证明了在一天内完成微生物鉴定和药物敏感性试验的可行性。为获得更好的治疗争取了时间并且减少了住院的费用[27]。

4.检测结果的影响因素 有研究指出不同的血培养瓶和血培养系统可能会产生鉴定结果的差异[19, 28, 29]:使用含有活性炭的血培养瓶和BacT/alert血培养系统的鉴定率较低, 使用含有树脂的血培养瓶和BACTECTM血培养系统鉴定率较高。其中一项研究比较了含有活性炭的和不含活性炭的血培养瓶在BacT/alert血培养系统下的鉴定表现, 发现使用不含活性炭的血培养瓶的MALDI-TOF MS的鉴定率为30%, 而含有活性炭的血培养瓶的鉴定率只有8%[28]。而另一项研究比较了3种不同的血培养系统— — BACTECTM, VERSATREK和BacT/alert对鉴定率的影响, 经这些鉴定系统培养的阳性血培养瓶的鉴定成功率分别是76%、69%和62%[29]。此外, 使用不同的细菌蛋白提取程序也会影响鉴定成功率[11]。

(二)泌尿系统感染病原菌的快速检测

因泌尿系统感染的中段尿样本中的细菌量相对很高, 中段尿样本也是MALDI-TOF MS直接检测的理想选择[30], 并且常常是单一菌种感染, 避免了MALDI-TOF MS在鉴定混合菌样本的不足[31]。泌尿系统感染是人类常见的感染性疾病, 临床泌尿系统感染最常见的病原菌为大肠埃希菌(70%~95%)、腐生葡萄球菌(5%~10%)以及其它肠杆菌科细菌, 如奇异变形杆菌和肺炎克雷伯菌。有研究表明MALDI-TOF MS对尿液样本中这些细菌的鉴定效率和准确率要优于传统鉴定方法和其他鉴定系统[7, 32, 33]。

1.鉴定效能 FERREIRA等[7]选取尿液中细菌大于1× 10^5 cfu/mL的样本进行直接的MALDI-TOF MS鉴定, 结果显示尿液样本经过差速离心法处理后, 可将91.8%的菌株鉴定到种、92.7%的菌株鉴定到属的水平。

杨溪等[33]使用MALDI-TOF MS技术对临床收集到的1 040份尿液样本进行直接快速检测, 共鉴定出含细菌的样本526份, 其中尿细菌培养菌落数≥ 1× 105 cfu/mL, 培养出1种/2种菌的尿液样本MALDI-TOF MS的直接鉴定率分别为92.7%(430/464)和75%(96/128)。MALDI-TOF MS直接检测法的鉴定结果与尿细菌培养法鉴定出的细菌菌种一致, 符合率为100%。

2.与流式细胞术联用 怀疑泌尿系统感染的尿液样本一般经离心后取沉淀直接进行检测, 但考虑到临床上有60%~80%的尿液样本是阴性的, 为了减少分析的时间和人工的工作量, 有学者将MALDI-TOF MS与流式细胞术联用检测, 用流式细胞术筛除细菌数量不足的尿液样本, 而MALDI-TOF MS用来检测筛选结果为阳性的尿液样本, 取得了良好的鉴定效果[34, 35]。MARCH ROSSELLÓ 等[34]建立了这样一种微生物鉴定程序:先用流式细胞仪进行菌落计数筛查出单一细菌阳性的尿液样本, 然后再进行MALDI-TOF MS检测, 发现细菌数在1× 10^7 cfu/mL时是足够的细菌浓度, 有87.5%的敏感性, 而细菌数在(1× 10^5)~(1× 10^7)cfu/mL之间的样本经过4 h的预增菌, 得到用于分析的足够的细菌数量后, 可以达到91.7%的敏感性。

3.细菌含量对鉴定结果的影响 由于中段尿中病原菌数< 1× 10^5 cfu/mL时也有可能预示着尿路感染, ROSSELLÓ 等[12]研究了不同细菌浓度对直接鉴定准确率的影响, 结果表明大多数情况下细菌数≥ 1× 10^5 cfu/mL的样本能产生更高的鉴定分数(接近或> 2.0), 而随着样本中细菌数的降低, 鉴定成功的比例和鉴定分数也在下降, 当菌落数< 1× 10^4 cfu/mL时, 不能得到可靠的鉴定结果; 并且发现在每一个细菌浓度下, 肠杆菌科的细菌均显示了更高的鉴定分数和鉴定准确率; 革兰阴性菌的鉴定分数和鉴定成功率要比革兰阳性菌高, 这与在血样本直接鉴定得到的结果一致; 对于4株酵母菌样本, 2个菌落数≥ 1× 10^5 cfu/mL的样本能被准确鉴定, 而菌落数在(1× 10^4 )~(5× 10^4)cfu/mL时则不能鉴定。而王琳等[36]的研究发现, 单一菌感染且细菌数> 1× 10^4 cfu/mL的中段尿样本, 应用MALDI-TOF MS直接检测即可取得满意的鉴定效果。

4.中段尿样本直接检测的新方法 DEMARCO等[31]近期描述了一种透析过滤的方法, 通过脱盐、分馏、富集等步骤对100例阳性尿液样本在MALDI-TOF MS分析前进行了预处理, 实验结果表明这种预处理方法能够正确地鉴定阳性尿液样本, 并且正确分类了所有临床相关菌尿症的阴性尿液样本, 包括一组污染的尿液样本和一组临床上无关紧要的定植菌。敏感性和特异性分别是67%和100%。

5.中段尿样本直接检测的不足之处 与直接检测培养阳性的血样本一样, 对于含有2种或2种以上细菌感染的中段尿样本, MALDI-TOF MS常常表现为鉴定能力不足[33, 35]; 尿液蛋白质如α -防御素[8]会造成鉴定结果不能正确匹配数据库; 对酵母菌的鉴定能力也有待于进一步提高; 对于核糖体蛋白序列差异很小的菌种也常常不能区分。

(三)其它无菌体液

MALDI-TOF MS直接检测和鉴定其它无菌体液样本如脑脊液、胸腹水和关节液等中细菌的报道尚不多。NYVANG HARTMEYER等[37]首次报道了通过直接将脑脊液样本离心取上清直接进行MALDI-TOF MS分析, 肺炎链球菌性脑膜炎可以在30 min内做出诊断, 为后续治疗方案的选择和结果的解释提供了重要的参考依据。SEGAWA等[38]也用同样的方法对一例肺炎克雷伯菌引起的脑膜炎做出了诊断, 但同时也指出在实际应用中能获得的样本量少, 细菌数少可能会限制它的应用。另外, 还可将无菌体液样本转移到血培养瓶中进行孵育, 待报阳后进行检测也是可行的。有研究应用MALDI-TOF MS检测了46份液体, 包括移植养护液、关节液、深部脓疱样本、骨小孔样本用血培养基孵育, 发现44/46(96%)能鉴定到种的水平, 余下的2份被鉴定到属的水平[18]。