基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted
laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF
MS)是20世纪80年代发展起来的一种新型软电离有机质谱, 作为一种新兴的蛋白质组学检测技术,
现已广泛应用于生命科学及相关领域。同时作为一项新兴的微生物鉴定技术, 受到了国内外的广泛关注。与传统的生化表型鉴定方法和分子生物学方法相比,
MALDI-TOF MS具有操作简单、快速、准确和经济的特点。早在1975年,
ANHALT等[1]利用质谱仪结合高温裂解技术第1次完成了细菌的鉴定, 从此拉开了质谱鉴定细菌的“ 序幕” 。随着质谱检测技术的不断完善和发展,
近年来, MALDI-TOF MS已经成功应用于微生物的鉴定, 显示了其在细菌、酵母菌等鉴定方面均具有良好的应用价值。众多的研究表明,
MALDI-TOF MS技术对培养出的纯菌落进行菌种鉴定具有很高的稳定性及准确性, 对常见细菌和酵母菌的属的鉴定率能达到97%~99%,
种的鉴定率也能达到85%~97%; 另外, MALDI-TOF MS大大缩短了细菌鉴定的时间, 而且其成本也较常规鉴定方法低[2,
3]。除此之外, MALDI-TOF MS已经能够成功地用于部分微生物亚种水平的鉴定和细菌耐药性的检测,
但这种方法在大多数情况下是应用于培养出的纯菌落的鉴定[3]。
如果能够从临床样本中直接检测细菌/真菌,
突破细菌/真菌培养阳性率低、培养时间长的瓶颈, 为细菌/真菌感染性疾病的诊疗提供更快、更准确的病原学依据,
将对临床及时控制细菌/真菌感染性疾病起到更大的作用。国内外学者已尝试将质谱技术应用于临床样本的直接检测,
并取得了显著的进展。本文就MALDI-TOF MS技术在临床样本的直接检测应用作一综述。
一、MALDI-TOF MS检测原理
MALDI-TOF
MS技术用于微生物鉴定的实质就是检测具有属、种或亚型特异性的生物标志的质量信号,
主要是微生物菌体内高丰度、表达稳定和进化保守的核糖体蛋白。MALDI-TOF MS
仪器主要由基质辅助激光解吸离子源(MALDI)和飞行时间质量检测器(TOF)两部分组成。MALDI的原理是用一定强度的激光照射样本与基质形成的共结晶薄膜,
基质从激光中吸收能量而汽化, 并迅速降解, 使样本分解吸附, 基质和样本之间发生电荷转移从而使样本分子发生电离;
TOF的原理是带有电荷的样本分子在电场作用下加速飞过飞行管道, 因为离子的质荷比与离子的飞行时间呈正比,
所以不同质量的离子因达到检测器的飞行时间不同而被检测,
以离子峰为纵坐标、离子质荷比为横坐标形成特征性的质量图谱。将不同种属微生物经MALDI-TOF分析所形成的质量图谱与数据库中的参考图谱进行比较,
从而实现对目标微生物种或菌株的区分和鉴定[2]。
二、MALDI-TOF MS直接检测临床样本的流程
临床样本直接检测的流程主要包括3个部分:临床样本的预处理、样本上机检测和对比蛋白质指纹图谱数据库得出鉴定结果。由于目前报道最多的临床样本是阳性血培养瓶和中段尿样本, 下面将以这二者为例介绍其直接检测的流程, 其它临床样本的检测流程与之类似。
(一)临床样本预处理
MALDI-TOF
MS直接用于临床样本的检测有2个基本的要求:(1)临床样本中细菌的量。为了得到准确的鉴定图谱, MALDI-TOF
MS技术对置于靶板上的细菌的最低检测限约为(1× 10^4)~(1×
10^6)cfu/mL。若要直接检测拟似血流感染的血液样本以及拟似泌尿系统感染的中段尿等临床样本中的病原菌, 首先必须富集细菌;
(2)临床样本的质。由于血液和血培养瓶中的大分子成分如血红蛋白和其它蛋白成分、尿液中的白细胞等有机成分会干扰细菌的谱峰,
所以直接检测前需要采取预处理措施去除这些干扰因素。
1.阳性血培养瓶直接检测
直接检测阳性血培养瓶的细菌浓度常常需要1× 10^7 cfu/mL[2, 4]。由于在血流感染患者血液中的细菌量常常很低(最低可<
1~10 cfu/mL), 因此对血样本的直接检测需要一个增菌的过程, 即采用血培养瓶增菌。目前已报道的阳性血培养病原菌预处理程序各不相同,
但预处理过程主要包含了以下2个步骤:(1)将细菌从血细胞中分离出来。先应用温和去污剂(如吐温-80、十二磺基硫酸钠、皂素等)将血液中的血细胞溶解,
然后通过不同的流程(离心、洗涤)去除其它的干扰因素, 纯化要鉴定的细菌样本; (2)将菌体中的蛋白质抽提出来。最常用的是混合溶剂处理法,
使用甲酸/乙腈溶液对样本进行处理来抽提蛋白, 利用2种溶剂的混合作用将菌体表面的蛋白和存在于细胞内的低相对分子质量的高丰度蛋白提取出来,
实现对菌株的鉴定。虽然至今尚没有规范化的处理程序, 不过目前市场上已有商品化的阳性血培养瓶预处理试剂盒Sepsityper
kit(Bruker)可以提高鉴定分数和鉴定准确率, 但是花费比较高, 处理程序也费时较长[5]。另外, HAMMARSTRÖ
M等[6]建立了一种基于声学捕捉和集成选择性富集目标(integrated selecive enrichment target,
ISET)的新方法用于富集样本中的细菌, 快速、准确并且简化了人工操作, 有望替代传统的以离心为基础的分离方法。
2.中段尿样本
要取得一个较高的鉴定成功率, 直接检测中段尿样本中病原菌至少需要的细菌数量是1× 10^5 cfu/mL[7,
8]。对尿样本的预处理程序较为简单, 主要有下面几个步骤:低速离心去除白细胞, 高速离心收集细菌, 沉淀,
经过洗涤、离心之后进行蛋白质的提取(常用的是甲酸、乙腈), 经高速离心后取1 μ L上清涂布到MALDI的靶板上, 在室温下干燥后即可进行检测。
(二)MALDI-TOF MS分析
目前主要有4种MALDI-TOF
MS系统[9]:MALDI Biotyper系统 (Bruker Daltonics, 德国), VITEK MS系统 (BioMé
rieux, Marcy l’ Etoile, 法国), the AXIMA@SARAMIS 数据库 (AnagnosTec, 德国)和the
Andromas (Andromas, 法国), 其中前2种质谱系统已获得中国食品和药品监督管理局许可证, 可以用于临床样本的检测。
在进行质谱分析前,
应根据不同的检测对象和使用的激光类型选择合适的基质。基质由基质复合物和基质溶剂组成。常用溶剂有:乙醇、乙腈和一种强酸如三氟乙酸、甲酸等。常用的基质是2,
5-二羟基苯甲酸(2, 5-dihydroxybenzoic acid, DHB)、ɑ -氰基-4-羟基肉桂酸(ɑ
-cyano-4-hydroxycinnamic acid, ɑ -CHCA)、3, 5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸(sinapinic
acid, SA)等。将经过提取的微生物样本细胞内容物与等量的基质溶液(通常是1 μ L)混合或分别点加在样本靶板上,
待室温条件下干燥后(使得样本与基质共结晶)上机检测即可。
(三)鉴定结果分析
将质谱检测得到的谱峰与数据库进行模式匹配,
得到一个鉴定分数。基于软件给出的在列表中第1种微生物的鉴定分数,
根据各自质谱分析系统的判断标准得出检测结果。目前文献报道有2种判断标准:第1种是由STEVENSON等[10]提出的,
鉴定结果按照匹配程度进行打分, 分值在0~3之间。当得到的鉴定分数≥ 2.0时, 表示待测菌株有较大的把握被鉴定到种的水平;
鉴定分数在1.7和2.0之间时, 表示菌株被鉴定到属的水平, 分值< 1.7表示产生的鉴定结果不可信。第2种标准是LA
SCOLA等[11]提出的, 当一个样本经过4次点样鉴定, 当列表中第1种微生物的鉴定结果均一致, 并且至少2次的鉴定结果鉴定分数≥
1.900, 或者4次的鉴定分数均≥ 1.200, 表明微生物能被正确鉴定。有学者发现通过改进上述的鉴定标准可以得到更好的鉴定效果,
ROSSELLÓ 等[12]认为在临床样本直接鉴定时, 鉴定分数要比直接纯培养的低, 可能会对分析结果造成干扰, 而厂商推荐的鉴定标准有些严格,
只有得到很高的鉴定分数结果才是被接受的。因此提出新的标准增加可接受的准确鉴定数:当一个样本4次点样中至少有2次的鉴定结果一致,
并且对列表中的第1个微生物种的鉴定分数均≥ 1.4时, 即表示能够准确鉴定,
这种标准与纯培养的鉴定结果有100%的符合率。NONNEMANN等[5]、GORTON等[13]将种的鉴定分数降到1.5,
可以将种的鉴定率从56%提升到76%、54%提升到63%。以上均提示了厂商推荐的cut-off值比较保守, 使得鉴定的敏感性降低。此外,
由于目前的数据库尚不完善, 对于部分菌株可能会出现鉴定失误的情况, 实验室工作人员应在商品数据库的基础上建立和丰富自己的参考数据库,
以提升鉴定的准确率。
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