如果以上都正常,还要确定下实验过程中的操作细节。
比如在做标准曲线的时候是否是梯度稀释的标准品,如果不是梯度稀释标准品,可能会引起标准曲线扩增效率或者R2值异常;
从冰箱冷冻中取出的试剂是否有混匀,如果试剂融化后没有混匀,这时候取出的试剂不是均一的,会影响后面的扩增;
定量PCR预混液跟核酸模板加好后是否混匀,如果没有混匀,特别是样本体积比较大的时候(超过PCR体系的20%),更容易发生optical mixing现象。
因为样本是水相会在上层,试剂(含有甘油成分)会在下层,在前期的PCR过程中不足以混匀完全,这样会形成折射,荧光较强,而一般加热几个循环后样本跟预混液会混匀,荧光就变稳定了(图十)。
图十:样本跟预混液未混匀现象
还有上机的反应体系里尽量不要有大的气泡,有气泡的话,中间容易形成折射,干扰荧光的采集(图十一)。所以实时荧光定量PCR实验的细节还是要特别注意的。
图十一:反应体系中有气泡
解决方案:将样本稀释后进行扩增(抑制物的影响可通过稀释样本消除)
手动设置基线。将Baseline End设置为“扩增信号出现的前一个循环”即,图片展原始为26,将其设置为20,点击OK即可恢复正常曲线。
(1)PCR参数设置错误:在设计循环参数时没有设置荧光信号采集;(2)模板降解: 避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况;(3)引物或者探针降解:可通过PAGE电泳检测其完整性;
PCR实验首次检测呈斜直线型扩增曲线,再次复检后结果基本均为正常阴性。- 分液不准确,检查检测后的反应管可发现管内的PCR反应液量明显少于正常管;
- 反应管气密性差,反应过程中溶液蒸发引起探针浓度增加,导至曲线呈斜直线状。
- 分液均匀,上机前检查八连管液面是否在同一水平线上;
PCR实验结果中有曲线出现末尾起跳但是没有完整扩增的现象。
(3)正常样本也可存在曲线末尾起跳,表示样本浓度低或者加样量不准确。- 排除污染原因后复检样本,如果复检后曲线为阴性直线则说明之前的末尾起跳为非特异性扩增,如果复检后曲线仍与之前一致则说明末尾起跳表示该样本中待检病毒核酸的浓度偏低。
严重的蒸发会呈现先上升后下降的曲线,轻微的蒸发会是一种缓慢的上升,这两类异常的曲线可以看一下检测后的反应管液面是否有下降的现象来证明。
(1)仪器不稳定导至的扩增曲线异常(也可能突然停电或者电压不稳);(2)如果尖峰向下,可能是卤素灯老化所致发射光源不稳定(指卤钨灯光源的激发器)(3)如果是单一的孔位出现尖峰,除了考虑仪器或者孔位问题外,还要考虑反应体系是否有气泡所致。qPCR实验室面临的最大问题就是核酸气溶胶污染的问题,每个实验室都要特别注意。