分子检测定性项目的性能验证

2021.6.23

王辉

致力于为分析测试行业奉献终身

为加强新冠病毒核酸检测能力建设，以更好满足新冠肺炎疫情常态化防控要求，去年至今各地新建和改扩建的PCR实验室数量快速增长。虽在每次举办的PCR培训班上我们都会重点讲解性能验证相关内容，但在实验室现场验收或督查过程中，仍发现不少实验室对性能验证相关知识并不是很清楚。今天就以新冠病毒核酸检测项目为例，和大家探讨一下分子检测定性项目性能验证的一些知识，希望能对大家有点帮助。

什么是性能验证？

对于从事临床检测工作的各位来说，性能验证这个词应该耳熟能详。但具体什么是性能验证？如何做性能验证？真问起来很多老师也确实没法准确回答出来。关于性能验证，IS015189(CNAS-CL02)中将其描述为“在常规应用前,应由临床实验室对未加修改而使用的已确认的检验程序进行独立验证。实验室应从制造商或方法开发者获得相关信息，以确定检验程序的性能特征。实验室进行的独立验证，应通过获取客观证据（以性能特性形式）证实检测程序的性能与其声明相符。验证过程证实的检验程序的性能指标，应与检验结果的预期用途相关”。很多老师觉得这句子读起来很是拗口，不好理解。其实简单来说就是：对于新开展的检测项目，实验室需要在本实验室特定条件下复现商品化试剂说明书中所列出的相关性能指标，如符合率、精密度和灵敏度等。

PS：有些老师还分不清性能验证和性能确认的区别。性能验证，验证的是有证产品；而性能确认，确认的是非标方法，如实验室自建方法，这两者是有本质区别的。

为何做性能验证？

为了验证实验室内检测系统可良好运行，有效保证实验室检测质量。

PS：有些老师认为既然试剂有证，就代表它质量可靠，那么实验室根本没必要做性能验证。但需纠正的是，性能验证并非仅针对试剂，它还包括了人员、仪器、环境等诸多因素，其验证的是实验室内一套完整的检测系统（人、机、料、法、环），因而上述看法是不对的。

何时需做性能验证？

检验程序常规应用前。
任何严重影响检测系统分析性能的情况发生后（包括但不限于仪器主要部件故障、仪器搬迁、设施环境的严重失控等），应在检测系统重新启用前对受影响的性能进行部分性能验证。
实验室增加新的检测系统时，新的检测系统包含现用检测系统的任一要素（仪器、试剂等）变更，如试剂升级、仪器更新等。

PS：新增检测项目时需做性能验证，大部分实验室都很清楚这点。但有些实验室在新增/变更部分仪器/试剂的情况下，认为仅进行系统间比对即可，这并不符合相关要求，此种情况下也是需按照新系统进行性能验证。

性能验证前的准备

操作人员应经过培训，熟悉所用方法原理与操作。
仪器经过校准，各项性能指标合格。
实验室设施及环境符合工作要求。
试剂满足要求。
性能验证人员应了解验证方案、制定验证计划并组织实施。

PS：然而，在进行性能验证前，有些实验室并未按上述要求进行准备。如实验室无人员培训记录，检测人员无法对性能验证数据进行现场分析解读；部分仪器未经校准后即投入使用；实验室使用两种检测试剂（如新冠病毒核酸检测），但在查看记录时却发现两种试剂性能验证方案间存在较大差异，问其如何制定性能验证SOP文件？却发现实验室根本就没相关SOP文件。上述情况下，实验室如何保证所用检测系统的性能验证是合格的？

如何做分子检测定性项目的性能验证？

目前合规开展的临床检测项目要求使用有证商品化试剂，因而常规使用前都需做性能验证。虽不同定性项目检测技术（如PCR、Sanger 测序或NGS等）的性能验证参数有所侧重，但其中最为重要的性能指标（符合率、精密度和检出限）是必须进行验证的。但在具体实践中，仍有不少实验室对于性能验证所用样本类型、样本数量和具体方案等存在诸多疑惑，下面以新冠病毒核酸检测项目为例简单介绍一下。

符合率

验证要求：通过与参比方法进行比较。参比方法：金标准方法、行业公认方法、经验证性能符合要求满足临床预期用途的方法(如：通过 ISO15189 认可实验室使用的相同检测方法)。
验证方案：

样本：阴性样本不少于10例、阳性样本(应含弱阳性/低扩增的样本)不少于10例。若无法获得足量临床阳性样本，可对其进行稀释或使用人工制备样本（如假病毒颗粒、质粒等）等获得类似效果；阴性样本中应包含与检测对象核酸序列具有同源性、易引起相同或相似临床症状的样本，如新冠病毒核酸检测项目，阴性样本可包含其他冠状病毒或流感样本等。

验证方法：按照患者样本检测程序，采用参比方法和候选方法平行检测，结果可绘制成2×2表，计算符合率。

精密度

样本：新鲜或冻存的阴性和弱阳性样本各一份。对于无法获得足量临床阳性样本的项目，可对临床阳性样本进行稀释或使用人工制备样本（如假病毒颗粒、质粒等）。
验证方法：每天检测3-4次，连续检测5天，阴阳性样本符合率≥90%。如对新冠病毒核酸检测项目，其阴阳性样本的符合率应为100%，同时阳性样本重复检测Ct值的变异系数（CV）应＜5%。

检出限

验证要求：所用检验程序在厂家试剂使用说明书等有声明检出限时，检测项目在有标准物质时，或以定量形式表达定性结果时，应进行检出限的验证。
样本要求：定值标准物质（如：国际参考品、国家参考品、厂家参考品）。对于报告具体基因型的方法，其选用的标准物质需包括所有的突变类型。对于检测对象同时含有不同比例的不同基因型时，应设置多个梯度，主要从扩增反应终体系总核酸浓度和突变序列所占比例两个方面进行评价。
验证方法：使用定值标准物质的样本梯度稀释至厂家声明的检出限浓度，可重复测定5次或在不同批内对该浓度样本进行20次重复测定（如测定5天，每天测定4份样本）。稀释液可根据情况选用厂家提供的稀释液或阴性血清，该阴性血清除被验证的目标物必须阴性外，所含干扰物质浓度必须在厂家声明的范围之内。如对于新冠病毒核酸检测项目，可选用有证的定值标准物质或定值质控品样本。
判断标准：如果是5次重复检测，必须100%检出靶核酸；如果是20次检测，必须检出至少18次靶核酸。

当然，除上述符合率、精密度和检出限等性能指标外，实验室也可根据自身情况对试剂说明书中的其他性能指标进行验证，如交叉反应和抗干扰能力等，不过这并不是强制要求的。

再需提醒各位的是，性能验证是保证实验室检测质量非常重要的一个环节。但正如前面所提及的，有些实验室准备工作尚未做好就进行性能验证，如此性能验证的结果并不可靠。再有不少实验室性能验证操作并非本实验室检测人员所做，而是由厂家技术人员代为进行。即便厂家所做结果没有问题，但因实验室检测系统中至关重要的人员并未参与其中，这又如何保证本实验室检测系统的检测质量呢？更何况在某些情况下，厂家技术人员可能并不会认真对待性能验证，而是敷衍了事草草应付。下面放一张我在实验室验收时看的一份新冠病毒核酸检测的性能验证报告，各位可先看看这个报告是否存在问题？