（二）操作
上面大篇幅都围绕Ph展开，因此不难想象Ph是标记优化的一个关键点，总结起来就4个字——高效、稳定。很多流程里，摸索最佳Ph都是优化标记的第一步，但是如果大家对第一话《烧金》的内容还有印象的话，那么标记的第一步首先应该是找到合适的容器，因为胶体金有洁癖。
1.容器：
推荐用清洗过的西林瓶（玻璃瓶）。因为两点原因，不推荐用ep管，一是不干净，你可以做个实验，拿十几个离心管，装好胶体金，其他什么都不加，用力摇晃，会发现金子颜色变化，严重的情况是金子直接变深紫、甚至变黑，轻微的情况是金子稍微偏紫一些，这是因为离心管不干净导至的死金，如果其随机发生在标记过程中，结果会难以分析。二是容易产生吸附，尤其是在用高倍金（比常用的1/万浓度高的金）标记重组抗原的时候。
万一你图省事，用离心管随便做做，至少要用超纯水多洗几次，包括与胶体金接触的枪头。说到枪，在少量标记时，如果用枪混匀，一定要慢吸慢放，快了的话，金子从枪头上行接触到枪末端，一个是对枪不好，再一个金子会死的很难看。
2.最适Ph：
1）取6个玻璃瓶，每个加1ml胶体金（1/万浓度，也可以做个10个8个的梯度）。
2）分别加入0.2M碳酸钾0、2、4、6、8、10ul，加入之后马上、充分混匀。（注意：加进去碳酸钾要马上混匀，不然的话，碳酸钾会自然沉降到底部，导至局部离子强度过大，严重的情况会导至底部的金子直接死掉，变成黑色，而上面的金子是正常的红色，出现明显的分层现象。）
3）分别加入10ug待标记原料，混匀，反应30min，观察颜色变化。（标记时间后续需要优化，分析颜色变化有利于了解原理和解决问题）
4）分别加入10%的BSA 100ul，混匀，反应30min。观察颜色变化。
5）离心，4℃，9000rpm，15min，上清尽量取干净。（机器不同，金子大小不同会有差异，具体根据离心效果看，上清干净即可。正常情况下，离心后沉淀蓬松，管壁无沉淀）
6）1/10体积复溶（注意复溶表现，有无不溶颗粒物），喷金6-9ul/cm，与划好的膜一起组装检测，符合性能要求的前提下（或者性能相差不太大的情况下），尽量选择远离变色临界点的条件为最适Ph。
3.讨论：
1）一个最佳Ph实验，需要一个完整的生产、检验过程，不要奢望看个颜色，加个NaCl就出结果了，想想我们优化Ph的初衷——稳定、高效，首先是获得一个稳定的标记物和稳定的生产过程，也就是从头到尾不死金，再一个就是产品的性能符合要求。
标记物再稳定，产品性能不合格，也是枉然；性能合格，操作重复性或产品稳定性差，也是白瞎。
我们来看一下NaCl滴定为什么不适用（NaCl滴定的原理在第一话中讲过，是基于盐离子对疏水胶体稳定性的破坏作用）。
首先，低标记ph下，蛋白会带更多的正电荷，金标物之间的斥力会比较小，但这时标记的效率较高，而高标记效率往往是我们追求性能时所需要的，这时我们如果加NaCl进去，会很破坏本就脆弱的斥力，进而出现死金现象，但是在正常操作时我们会用BSA进行封闭，这个封闭不仅能封闭金子表面，更重要的是，他使金标复合物带了更多的负电荷，使标记物更加稳定。所以，NaCl法没有考虑到封闭的稳定作用，NaCl滴定不稳定，不代表封闭后也不稳定；再一个，NaCl滴定会误导我们选择性能较低的条件（ph偏高一些），当然这也有一点好处，就是选择高的标记ph条件对放大生产的稳定有利。
上面这种情况是NaCl滴定能够得以顺利实施的情况下表现出的缺陷，在其他一些特殊情况下，NaCl滴定法可能没办法实施，比如，标记后的复合物本身斥力足够大，你又过量标记，加NaCl进去都不变色；又或者金子质量太差，或原料特殊，加进去NaCl所有条件都变色，甚至不加NaCl大部分条件都变色，这时你如果跟随NaCl的脚步，不一定带到哪条沟里去了，纠结于此往往不能发现背后真正的原因和解决方法。
对于部分IgG1型的抗体，NaCl滴定选择的条件会接近性能实验结果，但即使都是IgG1型抗体，标记、离心时的表现也会有很大差异，所以优化标记应以稳定高效的性能目标为指导，抛弃文献中的NaCl滴定法。
2）关于调节金子Ph：
常用的是碳酸钾梯度调节，Ph随着加入体积的增加而升高，这是一个相对连续的调节方法。有些公司使用缓冲液调节Ph，方法是加入相同体积、不同Ph的缓冲液，比如加入1/20的7.2的PB、8.0的BB、9.6的CB等等，这是一种跨步式的调节方式。两种方式调节均以加入量为参数，不必纠结具体的Ph数值，当选出最合适条件后，可以想办法检测一下这个点的Ph数值，在生产中作为一个质控点。
碳酸钾调节的优点是可以细化很多Ph梯度，从而利于追求性能，缺点是过于追求性能情况下，在临界状态附近放大标记，容易出现死金。
等比例放大，标记的整体Ph环境相同（1ml和几百ml，操作无错误，最终的胶体金Ph是一样的），那为什么小量标记没事，放大会死金呢，这是一个比较困惑的问题，可以从两方面理解（这只是我的推论，有助于理解现象）：
一是“狼多肉少”，胶体金是狼，蛋白是肉，少量标记时，假设在反应中心，1个金子标记上了蛋白，这时在反应区域外有9个等待标记的金子虎视眈眈，他抱着蛋白往外突围，走一步撞上1个金子，对方说“队长，别开枪，是我”，原来他走的同时，对方也标记上了蛋白，这时竞争比例变成了2:8，再走一步，比例变成了5:5，他最终突围出包围圈后，所有金子都标记好蛋白了，突围过程很从容，大家谁也不会抢谁的，相安无事。但是放大标记后，他突围了一层包围圈，遇到的是新的一批未标记的金子，再次勉强突围后，迎接他的又是新的一批没标记的金子，谁也别废话了，动手吧，最终抢来抢去，一个蛋白连上了多个金子就死金了。也就是放大标记中，整体Ph环境一致，蛋白的结合倾向是一致的，但是从反应中心扩散到整个区域的过程中，一个蛋白需要面对更多的金子的争抢，所以放大标记比小量标记容易死金。
另一个原因是局部ph降低，加入蛋白意味着引入了缓冲液（蛋白保存液），一般蛋白的保存液是PB，会拉低局部的Ph，放大标记，加入的蛋白保存液量明显增加，在这个局部反应区域内，蛋白是在低Ph环境下标记，更容易死金。
以上通用的解决办法就是要把标记Ph提高一些，在临界状态之后，性能满足要求的前提下，尽量往高提，能提高多少视蛋白结构和金子浓度而异。高倍金放大死金的风险远远高于常用的1/万金。
而缓冲液标记放大死金的风险相对较低，可能有两方面原因，一是本身缓冲对的缓冲能力大于单纯的碳酸钾，二是已经人为的加大了Ph的跨度（相当于碳酸钾梯度做大了，你选择的最优点已经是远离临界状态的安全点了）。
3）最适蛋白量：
过程类似，在最适Ph点上，把标记蛋白量做个梯度优化，梯度范围1ml金子加5-20ug蛋白。
优化标记量是因为免疫反应有比例性，夹心法一般标记量增加，一个金子上面标记上的蛋白就越多，与待测物反应越充分，整个复合物被T线捕获的机率也越高，灵敏度就越高，这个前提是上清游离原料去除干净，而这其实并不容易，所以标记浓度高了，游离抗体去除不干净引起的竞争效应会越明显，灵敏度反而降低，另外过饱和标记Fc相对隐蔽，对C线显色也有影响（参照下图，涛哥形象的画风）。
而竞争法相反，标记量越低，金子上的抗体越少，与阳性样本反应后，金子上留给T线的未反应抗体就越少，越利于消线，灵敏度越高。
优化蛋白标记量的主要筛选标准是产品性能，标记多少对金标物稳定的影响不是主要考虑项，所以更用不到NaCl滴定法。
4）封闭：
一般的文献都会说封闭是为了封闭金子表面的活跃位点，避免层析中出假阳，慢慢会发现除了这点，还有两个重要作用，一是稳定标记物，二是提供离心环境，这两个作用出镜率不及“封闭位点”，但是随着了解的更加深入，你会发现封闭表面的作用太肤浅了，“稳定标记物”和“提供离心环境”才是最重要的，解决死金的思路都在这里。
首推的封闭剂是BSA，质量很关键，涛哥有过长篇论述，不同厂家的BSA，在封闭时会有很大差异，所以，一开始选择一种好的BSA很重要（好在有人专门卖胶体金产品用的BSA，可以排除BSA厂家的因素，让你专注其他问题）。
如果操作过程中出现异常，观察每一步的实验现象会有助于发现和解决问题，与BSA相关的比如：
质量很好的BSA能够胜任绝大部分封闭工作，封闭离心复溶一切正常，而质量一般的BSA只能用于一部分标记单抗的封闭，如果标记特殊亚型单抗或者重组抗原，封闭没问题，但是离心会死金。
另外一些情况是，有些BSA溶解后是酸性的，用他封闭会导至标记蛋白带正电从而引起死金（可以尝试用Tris溶解BSA，整体呈碱性），有些BSA含杂质盐，用他封闭会破坏金标物的斥力从而引起死金。这两点基本上在封闭时就表现出异常了。
如果你常用的BSA没有换，标记的抗体也没有换，离心出现异常，多半是标记Ph和胶体金本身的质量问题。
在这里我想说一下我对BSA封闭机理的推论，我认为其主要作用力就是金硫键。BSA等电点4.7，我们标记时的Ph远大于其等电点，为什么一般情况下，我们标记抗体或抗原时，别说远远高于了，就是一般的高于等电点，标记后活性都大打折扣（标记效率极低），但是这个BSA封闭，无论什么Ph都能很好封闭胶体金裸露位点，而且还是人家抗体不愿意（难）结合的剩余位点，虽然BSA过量是一个因素，但是如果是很高的标记Ph，过量的蛋白进行标记也是浪费。不否认BSA浑身负电，仍有正电基团，但是Ph远远高于等电点，正电基团数量少得可怜，所以正负电荷引力难堪重任，甚至相互吸引接触都成问题。如果说主要靠疏水，在强大斥力存在时，疏水基团碰撞结合的几率也很低，那为什么其他蛋白远离等电点时，疏水结合很难起作用，但BSA却能很好结合？
所以最后只有一种可能，就是金硫键，BSA有581（也有说583）个氨基酸残基组成，分子量66.4KD，其中有35个半胱氨酸，组成了17个二硫键，在肽链的第34位还有一自由巯基。这个自由巯基很容易与胶体金形成共价结合，而且共价结合力远远强于静电和疏水，同时他不受Ph条件的影响，并且共价键具有饱和性，所以一个BSA只能通过一个自由巯基结合一个胶体金，不会引起金子的聚集，但是一个胶体金可以结合多个BSA，所以封闭后的金标物带有更多负电荷，能够更稳定、更分散。
实验现象表明BSA的加入，会让某些轻微变紫色的金子回复成红色，这是本已聚集的胶体金颗粒重新分散的表现，这说明BSA在封闭时有很强的负电斥力，并且很高效的结合到了胶体金上，与上面的推论相吻合。
所以我认为，金硫键是BSA封闭胶体金时的主要作用力。关于BSA的封闭机理，每个人会有各自的看法，至少目前没有统一的定论，这只是我根据几种作用力的原理及实验现象得出的推论，大家看看就行，反正不知道原理，直接用也不会有问题。
另外一个常用的封闭剂是酪蛋白，比BSA保护作用更强，甚至标记时已经死了的金都能安全离心，这是一件好事，也是一件头疼的事，可以慢慢体会。但是刚接触一个项目的时候，不建议用酪蛋白封闭，如果对反应体系不了解，酪蛋白封闭容易筛选出有缺陷的原料，从而引发一系列意想不到的问题。常见的降低灵敏度、产品特异性缺陷，罕见的金子释放异常等。
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