1、目的
这个指南建立了检测玉米(没有经过加工的玉米产品)中是否存在 StarlinkTM 玉米并出具官方被提供结果的程序。在美国谷物标准法(USGSA)的授权下,这个服务作为官方标准。
2、背景
由 Aventis 作物科学公司开发的 StarlinkTM 玉米,是运用现代生物技术的方法,导入从细菌苏云金秆菌(Bt)来的遗传物质经过遗传改良而得到。结果, StarlinkTM 玉米产生了一个蛋白质 Cry9C,具有杀虫活性,能够有效控制欧洲钻心螟虫,美国环境保护局在1998年批准 StarlinkTM 玉米仅仅做动物饲料用。
试剂盒 能在0.25%(400粒中有一粒 StarlinkTM 玉米)水平检测 StarlinkTM 中的 Cry9C 蛋白。
测试方案不能准确检测样品中 StarlinkTM 玉米的百分含量。检测的仅仅是根据样品的数目和大小,在一个指定的含量内,判断一个样品是否含有 Cry9C 蛋白。
其他 Cry9C 蛋白检验试剂盒,在被开发、评估和得到官方批准可使用之后其使用程序将会被公布。
3、检验可信度
基于取样理论,每一扦样批货物的大小对样品大小有重要的影响,这是谷物检验的一般原则,总的样品大小由可能接受的指定含量决定。分析方法的局限性决定了必须检验多少个小样。
官方扦样程序已经被发展为实用程序,用来获得随机样品。增加样品量能增加在低水平下检测的可信度;然而,大样品的可靠结果仅能通过检验多个小样而获得。
下表说明了用试剂盒 Trait V Bt9 Lateral Flow Test Kit 检验含有400粒的样品获得的。通过测试多个含有400粒的小样,该表提供了在5个置信水平上的信息,该表提供了在所有的试验样品出现阴性结果时,所期望的 StarlinkTM 最高百分含量水平。
试验样品出现阴性结果与 StarlinkTM 最高百分含量水平关系
编号 使用400粒的小样大小在5个不同可信水平的 StarlinkTM 百分含量
50 75 90 95 99
1 0.17 0.35 0.58 0.75 1.2
2 0.087 0.18 0.29 0.38 0.58
3 0.058 0.12 0.20 0.25 0.39
4 0.045 0.085 0.15 0.19 0.29
5 0.035 0.070 0.12 0.15 0.25
6 0.029 0.058 0.10 0.13 0.20
7 0.025 0.050 0.085 0.11 0.18
8 0.022 0.044 0.075 0.10 0.15
分析一个小样,如果结果是 Cry9C 蛋白阴性,则一个扦样批中不含有超过1.2%的 StarlinkTM 玉米的可能性为99%,同样如果分析两个小样,两个结果都是 Cry9C 蛋白阴性,则一个扦样批中不含有超过0.58%的 StarlinkTM 玉米的可能性为99%。
4、样品准备
(1)警告 检验人员一定要额外小心,以免粗心混杂,确保样品的整体性。在官方样品中混入一粒外来样品就能影响试验结果。保证样品收集装置(例如取样铲子、收集斗)和实验设备(样品袋子、容器和分样器)没有残留谷物。
(2)样品大小 根据《谷物检验手册子》第一册《谷物取样》的程序取样。使用认可的分样器获取需要分析小样,保证原始样品大小能足够提供所有要求的小样的分析,用作测试样品,一般的刻度天平,可用作称量样品的缩分样。
分析的小样是115g(±5g)或大约400粒。这个大小要求适于所有的服务,包括呈送样品。如有必要,通过称100粒重然后乘以4来调节分析缩分样大小至大约400粒。
(3)测试的基础(分析缩分样大小)除非申请者另有指定,应把分析建立在样品作为一个整体之上(在去除破碎粒和杂质之前)。
5、测试程序
(1)加工样品
①取小样测试缩分样(大约400粒),用一般的刻度天平来称重。
②把小样放到一个干净干燥的用作捣碎的容器中(容器必须具有最小16液体盎司的容量)。
③将一个干净、干燥的刀片安装到混合装置上(食品加工器或混合器),在容器上放一个塑料保护罩,以防在样品加工时,容器破裂。
④以高速磨碎小样直到所有整粒被打碎(大约30s)。(注:也可用其他方法来磨碎小样,只要磨碎的颗粒的大小与混合器加工相一致,加工要以免交叉污染。)
⑤把小样从混合装置上卸下来,然后加入143～145mL 水。
在容器上放一个盖子反复摇动,湿润所有的玉米粉粒(大约10～20s),然后让成泥浆状的样品放置15～30s,小样应该浓稠但又含有自由流动的液体。
⑥使用检测试剂盒的提供的移液管将 0.5mL 液体从容器转移到 1.5mL 的样品管中。(注:一些玉米成分在这一步骤中被转移到样品管中。)
⑦加5滴 Trait V 样品缓冲液到样管中(小心:没有加5滴缓冲液到管中,可能引起假阳性结果。)
③盖上盖子,摇动大约10s。
⑨把1张 Trait V Bt99 测试条插入样品管中,让条带置于试管中直到控制线(顶线)清楚可见,如果样品是 Gry9C 蛋白阳性,测试线应在 10min 内形成。(注意:样品管中的液体不要浸没测试条带顶部的箭头。)
(2)Lateral Flow 测试条的结果分析在插入条带之后,要时常检查结果窗口,至少有一条控制线应该在储蓄垫下大约 1cm 处形成。在这个位置出现一条红线说明该测试条的功能正常。在控制线下出现的一条红线是测试线,这条红线表明测试结果是阳性。
6、设备清洗和废物处理
(1)清洗 混合容器和刀片必须用肥皂水清洗,再清水漂洗,在重新用前必须晾干。
(2)处理 将固体材料(如测试条,样品管,磨碎的玉米)扔到一个固体废物容器中进行常规处理。液体材料(过量的样品溶液)倒到下水道里。
7、仪器设备
(1)检测试剂盒材料 Trait V Bt9 Lateral Flow 测试条带, Traits 样品缓冲液,样品管(1.5mL),移液管。
(2)实验室设备 具有切割刀片垫片和混合/加工器的混合容器(至少453.6g),塑料保护罩,样品管架,有刻度的量筒。
8、贮藏条件
在室温下贮藏 Trait V Bt99 检测试剂盒(15.5～29.4℃)。把检测条保存在放有指示干燥剂的金箔小袋中,如果干燥剂不是蓝色,不要使用检测条或缓冲液。
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