自动化传导法（automated conductance）检测沙门氏菌

自动化传导法(automated conductance)
根据电阻抗测量的原理,关键是选用适宜的培养基,以保证任何电导(或电阻抗)的变化都是由目标微生物的生长所致,通过仪器检测电导(或电阻抗)的改变来确定是否存在被检微生物。马萨斯公司(Malthus Instrument Ltd)的 Mal-thus 系统是经 AOAC 认可批准的惟一用于检测(初筛)沙门氏菌的电导仪。其关键技术是在亚硒酸盐胱氨酸肉汤(沙门氏菌选择性肉汤)中使用了含如二水氧化三甲胺(TMAO)或盐酸三甲胺这样一类中性不带电荷的分子,当被细菌还原成三胺后,电导性质可明显改变。根据选用的专一性培养基不同,电导(或电阻抗法)还可用于大肠杆菌、李斯特氏菌、弯曲杆菌等的初筛检验。AOAC 991.38《食品中的沙门氏菌自动化传导方法》介绍如下。

AOAC 公定方法991.38为所有食品中推定存在沙门氏菌的检测方法。阳性试样必须用标准培养法加以确证。

1、原理
试样在缓冲蛋白胨水-赖氨酸-葡萄糖肉汤中进行预增菌,然后在含有三甲胺-N-氧化物(trimethylamine-N-oxide)和卫矛醇的培养基(沙门氏菌培养基1)及赖氨酸亚硒酸盐基础培养基(沙门氏菌培养基2)中进行2管传导检测。与那些非沙门氏菌相比,在这两种培养基中典型的沙门氏菌产生大量的电导变化。在48h 内可得出推定阳性结果。

2、仪器
(1)微生物学分析仪  于35℃进行分析仪器操作。根据在10kHz 的频率时记录下的传导变化来测量微生物的生长,在35℃将两个电极插入生长培养基检出变化,能测定出<100微西门子(μS)的传导变化。符合这些规格的仪器可从Malthus Instruments Ltd.,The Manor Royal Crawley,West Sussex RH10 2PY,U.K.处购得。Malthus 系统由具有IBM兼容专用计算机(PC)的1或2个分析器组成,并具有240试验电容量,能自动进行数据收集。

(2)自动移液器  能吸移100μL。

3、培养基和试剂
(1)和(2)项可从Malthus Instruments Ltd.购得。也可使用等效的培养基。

(1)前增菌肉汤  10.0g 细菌用蛋白胨、5.0g 氯化钠、3.5gNa₂HPO₄·2H₂O、1.5gKH₂PO₄·H₂O、5gL-赖氨酸、5g D-葡萄糖。混悬各成分于1L H₂O中,分装于带螺旋盖的容器内,每容器225mL,于115℃高压灭菌20min 最终pH值应为7.0±0.2。

(2)选择性传导培养基  (当心:培养基中含有亚硒酸氢钠,避免与皮肤接触。)①沙门氏菌培养基(Easter and Gbson)  混悬5.0g 细菌学用蛋白胨、10.0g 磷酸氢二钠、5.0g 卫矛醇、5.6g 三甲胺·HCl、4.0g 亚硒酸氢钠于1L H₂O中,加1mL L-胱氨酸溶液(经溶解0.1g L-胱氨酸于15mL 1mol/L NaOH中并用无菌水稀释至100mL 而制成的)。最终pH值应为7.0±0.2。
②沙门氏菌培养基2  混悬5.0g 乳朊水解物、10.0g D-葡萄糖、10.0g L-赖氨酸、4.0g亚硒酸氢钠于1L H₂O中。按(2)①,加10mL L-胱氨酸溶液。最终pH值为6.5±0.2。

用一细菌滤器对传导培养基(2)进行过滤除菌。以无菌操作,分装过滤后的培养基于灭菌生长室内或与自动传导分析器相适用的槽中。

(3)1mol/L 氢氧化钠溶液。

(4)1mol/L 盐酸溶液。

4、通则
在槽内的选择性导电性培养基必须贮存于4～6℃。从培养基制作的当日起于4～6℃可稳定3个月。接种前,使培养基恢复至室温。

包括阳性[鼠伤寒沙门氏菌,NCIMB 13034(National Collections of Industrial and Ma-rine Bacteria,Torry Research Station,PO Box 31,135 Abbey Rd. Aberdeen AB98DG,Scottland)]和阴性对照(大肠埃希氏菌ATCC 25922)以保证培养箱和分析器的正确功能。

5.样品制备
(1)前增菌  以无菌操作称取25g 样品放入装有225mL 前增菌肉汤的适宜容器中。根据不同的产品,混合和均质的方法亦异。若产品是液体的、粉末状的、碎的或粉碎的,可省去均质的步骤。将未经粉碎的和完整的产品均质2min。盖上容器,于室温下静置60min。混匀,用试纸测定pH值。如必要,用灭菌的1mol/L NaOH 或 HCl 调节pH 值至7.2±0.2。在测定最终pH值前,应将培养基混匀。以无菌操作,将样品移入一灭菌的带螺旋盖的500mL 容器内。旋松容器盖1/4圈于35℃培养16～24h。

(2)选择性增菌  移取0.1mL 经培养的前增菌培养液于装有沙门氏菌培养基1和2的一次性培养小瓶中。于35℃培养至达到可疑阳性结果的判定标准,最长培养至30h。

(3)再次培养  必须立即从得出可疑阳性结果的任何瓶中挑取1接种环肉汤按常规培养方法划线于 Hektoen 肠道琼脂(HE)、木糖赖氨酸去氧胆酸盐琼脂(XLD)和亚硫酸铋琼脂(BS)上,进行再次培养。

6、分析仪的安装
(1)用提供的电缆,通过 RS232端口连接分析器到一 IBM AT PC 兼容机上。

(2)将分析器和 PC 连接于总电源上。

(3)把冷凝管连接于冷凝器和分析器后面的插口中。

(4)把冷凝器连接电缆插到冷凝器和培养箱后面的 DIN 插座上。若仅使用一个分析器,必须用标有“Incubator 1”的插头。

(5)分析器水位的检测,打开并给水箱注入蒸馏水或无离子水,继续注入至指示器上显示出“STOP FILLING”字样。注水后,盖上分析器水箱的上口。

(6)把冷凝器连接于总电源上,但不接通电源。将3L 33%(V/V)乙二醇基础防冻液从冷凝器上部的小口注入冷凝器。冷凝剂最高注入至分析器指示上显示“STOP ADDING COOLANT”字样。

(7)确保 MS-DOS 被安装在 PC 上。打开 PC,当显示C>提示时,将软盘1(Malthus)放入A驱动器中。键入A:install,于是在荧光屏上出现提示。

(8)安装完毕。若在安装时选用了自动安装,则按 C/MALTHUS然后再按 MALTHUS,或reboot PC,输入程序。

(9)必须设定配置系统,方可使用分析器。从主菜单选择“SYSTEM”并按键,从程序初始菜单上,按照荧光屏提示选择“change config”(F6)。按 F10返回初始菜单。

(10)由“change temperature”选择键(F5),将分析器的温度设定为10℃。返回初始菜单并选择“start new test"(F1)。

(11)启动油泵,必须将冷凝器抽气减压,并从系统中驱除空气。设定温度后,等待10min。验查冷凝器管是否连接在冷凝器底部的接口(标有 OUT)。从分析器上的接口处取下该管,并将其末端放入低于冷凝器的适当容器内,使冷凝剂从管中排出直到无气泡出现。重新将该管接好。

(12)从主菜单上选择“UTILITIES”设定分析器的温度35℃。然后选择 “changetemp”(F7),在显示器控制板上可显示出分析仪器中水的温度。待温度稳定后再开始试验。

7、分析仪的操作
(1)确保系统的所有部件均已接好,并按照制造商的使用者指南进行操作。

(2)检查系统软件是否装入。分析器的显示器是否显示正确的培养温度(35℃)。若不正确,用“UTILITIES”选择设定正确的温度。

(3)往培养瓶中接种,并将瓶盖盖严拧紧。

(4)将培养瓶电极连接于瓶连接器的盖上,按压使其连接,避免用力过大。

(5)将培养瓶放入分析器中的一个洞内,并将连接器定位于印制电路板(PCB)相邻的洞中,向下压稳使其不转动。

(6)注意培养瓶在培养箱中的位置并作记录,用于进一步查证。

(7)样品一经放入分析器后,数据被自动地收集和处理。可疑沙门氏菌阳性的结果为光亮最强的试样,并应按9中所述进行确证。

8、解释
对于沙门氏菌培养基1推定阳性结果的判定标准是一个总传导变化≥200μS(微西门子)和最大变化率≥25μS/h,而对于沙门氏菌培养基2,总传导变化≥100μS,最大变化率≥25μS/h。

总传导变化和变化率由检测时间来测量。检出时间是由连续传导检视结果与一个试验瓶超出预定的临界值(0.8μS)之间的时间差来确定。

9、可疑传导阳性结果的确证
可疑传导法阳性表明可能存有沙门氏菌。所有推定阳性结果必须按 AOAC 967.25～967.28(沙门氏菌的鉴定方法)进行确证。