生活污水与工业废水中含有大量各类有机物。当其污染水域后，这些有机物在水体中分解时要消耗大量溶解氧，从而破坏水体中氧的平衡，使水质恶化，因缺氧造成鱼类及其它水生生物的死亡。这样的污染事故在我国时有发生。
水体中所含的有机物成分复杂，难以一一测定其成分。人们常常利用水中有机物在一定条件下所消耗的氧来间接表示水体中有机物的含量，生化需氧量即属于这类的重要指标之一。
生化需氧量的经典测定方法是稀释接种法；日本1990年颁布了微生物电极法（JIS K 3602—1990），其中使用了微生物膜传感器，每次测定仪需20 min。我国也研制出以微生物电极为核心的相关快速BOD测定仪，其方法已通过多家试验室验证，实际水样测定及与标准稀释接种法对照，取得了良好的效果。
测定生化需氧量的水样，采集时应充满并密封于瓶中，在0～4 ℃下进行保存，一般应在6 h内进行分析。若需要远距离转运，在任何情况下，贮存时间不应超过24 h。
一、稀释接种法
1.方法原理
生化需氧量是指在规定条件下，微生物分解存在于水中的某些可氧化物质，特别是有机物所进行的生物化学过程中消耗溶解氧的量。此生物氧化全过程进行的时间很长，如在20 ℃培养时，完成此过程需100多天。目前国内外普遍规定20 ℃±1 ℃培养5 d，分别测定样品培养前后的溶解氧，二者之差即为BOD5值，以氧的毫克/升表示。
对某些地表水及大多数工业废水，因含较多的有机物，需要稀释后再培养测定，以降低其浓度和保证有充足的溶解氧。稀释的程度应使培养中所消耗的溶解氧大于2 mg/L，而剩余溶解氧在1 mg/L以上。
为了保证水样稀释后有足够的溶解氧，稀释水通常要通入空气进行曝气（或通入氧气）使稀释水中溶解氧接近饱和。稀释水中还应加入一定量的无机营养盐和缓冲物质（磷酸盐钙、镁和铁盐等），以保证微生物生长的需要。
对于不含或少含微生物的工业废水，其中包括酸性废水、碱性废水、高温废水或经过氯化处理的废水，在测定BOD时应进行接种，以引入能分解废水中有机物的微生物。当废水中存在着难于被一般生活污水中的微生物以正常速度降解的有机物或含有剧毒物质时，应将驯化后的微生物引入水样中进行接种。
2.方法的适用范围
本方法适用于测定BOD5大于或等于2 mg/L，最大不超过6000 mg/L的水样。当水样BOD5大6000 mg/L，会因稀释带来一定的误差。
3.仪器
①恒温培养箱（20 ℃±1 ℃）；②5～20 L细口玻璃瓶；③1000~2000 ml量筒；④玻璃搅棒：玻璃搅棒的长度应比所用量筒高度长200 mm，在棒的底端固定一个直径比量筒底小、并带有几个小孔的硬橡胶板；⑤溶解氧瓶：250～300 ml之间，带有磨口玻璃塞并具有供水封用的钟形口；⑥虹吸管，供分取水样和添加稀释水用。
4.试剂
①磷酸盐缓冲溶液：此溶液的pH应为7.2；②硫酸镁溶液；③氯化钙溶液；④氯化铁溶液；⑤盐酸溶液（0.5 mol/L）；⑥氢氧化钠溶液（0.5 mol/L）；⑦亚硫酸钠溶液（1/2Na2SO3＝0.025 mol/L）：需每天配制；⑧葡萄糖-谷氨酸标准溶液：此标准溶液临用前配制。⑨接种液。
稀释水：在5～20 L玻璃瓶内装入一定量的水，控制水温在20℃左右。然后用无油空气压缩机或薄膜泵，将吸入的空气先后经活性炭吸附管及水洗涤管后，导入稀释水内曝气2～8 h，使稀释水中的溶解氧接近于饱和。曝气亦可导入适量纯氧。瓶口盖以两层经洗涤晾干的纱布，置于20 ℃培养箱中放置数小时，使水中溶解氧含量达8 mg/L左右。临用前每升水中加入氯化钙溶液、氯化铁溶液、硫酸镁溶液、磷酸盐缓冲溶液各1 ml，并混合均匀。
接种稀释水：分取适量接种液，加于稀释水中，混匀。每升稀释水中接种液加入量为：生活污水1～10 ml；表层土壤浸出液20～30 ml；河水，湖水10～100 ml。接种稀释水的pH值应为7.2，BOD5值以在0.3~1.0 mg/L之间为宜。接种稀释水配制后应立即使用。
5.步骤
（1）水样的预处理
①水样的pH若超出6.5～7.5范围时，可用盐酸或氢氧化钠稀溶液调节pH近于7，但用量不要超过水样体积的0.5％。若水样的酸度或碱度很高，可改用高浓度的碱或酸液进行中和。
②水样中含有铜、铅、锌、镉、铬、砷、氰等有毒物质时，可使用经驯化的微生物接种液的稀释水进行稀释，或提高稀释倍数以减少毒物的浓度。
③含有少量游离氯的水样，一般放置1～2 h，游离氯即可消失。对于游离氯在短时间不能消散的水样，可加入亚硫酸钠溶液除去。其加入量由下述方法决定：取已中和好的水样100 ml，加入（1＋1）乙酸10 ml，10％碘化钾溶液1 ml，混匀以淀粉溶液为指示剂，用亚硫酸钠溶液滴定游离碘。由亚硫酸钠溶液消耗的体积，计算出水样中应加亚硫酸钠溶液的量。
④从水温较低的水域或富营养化的湖泊中采集的水样可遇到含有过饱和溶解氧，此时应将水样迅速升温至20 ℃左右，在不使满瓶的情况下，充分振摇，并时时开塞放气，以赶出过饱和的溶解氧。从水温较高的水域或废水排放口取得的水样则应迅速使其冷却至20 ℃左右，并充分振摇，使与空气中氧分压接近平衡。
（2）不经稀释水样的测定
①溶解氧含量较高、有机物含量较少的地表水，可不经稀释而直接以虹吸法将约20℃的混匀水样转移入两个溶解氧瓶内，转移过程中应注意不使产生气泡。以同样的操作使两个溶解氧瓶充满水样后溢出少许，加塞。瓶内不应留有气泡。
②其中一瓶随即测定溶解氧，另一瓶的瓶口进行水封后，放入培养箱中，在20 ℃±1 ℃培养5d。在培养过程中注意添加封口水。
③从开始放入培养箱算起，经过五昼夜后，弃封口水，测定剩余的溶解氧。
（3）需经稀释水样的测定
①稀释倍数的确定。根据实践经验，提出下述计算方法，供稀释时参考。
（i）地表水：由测得的高锰酸盐指数与一定的系数的乘积，即求得稀释倍数，见表1。
（ii）工业废水：由重铬酸钾法测得的COD值来确定，通常需作三个稀释比。使用稀释水时，由COD值分别乘以系数0.075，0.15，0.225，即获得三个稀释倍数。使用接种稀释水时，则分别乘以0.075，0.15和0.25三个系数。
②稀释操作。
（ii）一般稀释法。按照选定的稀释比例，用虹吸法沿筒壁先引入部分稀释水（或接种稀释水）于1000 ml量简中，加入需要量的均匀水样，再加入稀释水（或接种稀释水）至800 ml，用带胶板的玻棒小心上下搅匀。搅拌时勿使搅棒的胶板露出水面，防止产生气泡。
按不经稀释水样的测定相同操作步骤进行装瓶、测定当天溶解氧和培养5d后的溶解氧。另取两个溶解氧瓶，用虹吸法装满稀释水（或接种稀释水）作为空白试验，测定5d前后的溶解氧。
（ii）直接稀释法。直接稀释法是在溶解氧瓶内直接稀释。在已知两个容积相同（其差＜1 ml）的溶解氧瓶内，用虹吸法加入部分稀释水（或接种稀释水），再加入根据瓶容积和稀释比例计算出的水样量，然后用稀释水（或接种稀释水）使刚好充满，加塞，勿留气泡于瓶内。其余操作与上述一般稀释法相同。
BOD5测定中，一般采用叠氮化钠改良法测定溶解氧。如遇干扰物质，应根据具体情况采用其他测定法。
6.计算
（1）不经稀释直接培养的水样
式中：C1——水样在培养前的溶解氧浓度（mg/L）；C2——水样经5 d培养后，剩余溶解氧浓度（mg/L）。
（2）经稀释后培养的水样
式中：B1——稀释水（或接种稀释水）在培养前的溶解氧（mg/L）；B2——稀释水（或接种稀释水）在培养后的溶解氧（mg/L）；f1一稀释水（或接种稀释水）在培养液中所占比例；f2——水样在培养液中所占比例。
7.精密度和准确度
三个实验室分析含5 mg/L葡萄糖的统一标准液的BOD5值，实验室内相对标准偏差为5.6％；实验室间相对标偏差为32％。三个实验分析含300 mg/L葡萄糖（BOD5为210 mg/L）的统一标准液的BOD5值，实验室内相对标准偏差为2.1％，实验室间相对标准偏差为2.19％。
8.注意事项
①水中有机物的生物氧化过程，可分为两个阶段。第一阶段为有机物中的碳和氢，氧化生成二氧化碳和水，此阶段称为碳化阶段。完成碳化阶段在20 ℃大约需20 d。第二阶段为含氨物质及部分氨，氧化为亚硝酸盐及硝酸盐，称为硝化阶段。完成硝化阶段在20 ℃时需要约100 d。因此，一般测定水样BOD5时，硝化作用很不显著或根本不发生硝化作用。但对于生物处理池的出水，因其中含有大量的硝化细菌。因此，在测定BOD5时也包括部分含氮化合物的需氧量。对于这样的水样，如果我们需要测定有机物降解的需氧量，可以加入硝化抑制剂，抑制硝化过程。为此目的，可在每升稀释水样中加入1 ml浓度为500 ml/L的丙烯基硫脲（ATC）或一定量固定在氯化钠上的2-氯代一6-三氯甲基吡啶（TCMP），使TCMP在稀释样品中的浓度大约为0.5 mg/L。
②玻璃器皿应彻底洗净。先用洗涤剂浸泡清洗，然后用稀盐酸浸泡，最后依次用自来水、蒸馏水洗净。
③在两个或三个稀释比的样品中，凡消耗溶解氧大于2 mg/L和剩余溶解氧大于1 mg/L，计算结果时，应取其平均值。若剩余的溶解氧小于1mg/L，甚至为零时，应加大稀释比。溶解氧消耗量小于2mg/L，有两种可能，一是稀释倍数过大，另一种可能是微生物种不适应，活性差，或含毒物质浓度过大。这时可能出现在几个稀释比中，稀释倍数较大的消耗溶解氧反而较多的现象。
④为检查稀释水和接种液的质量，以及化验人员的操作水平，可将20 ml葡萄糖一谷氨酸标准溶液用接种稀释水稀释至1000 ml，按测定BOD5的步骤操作。测得BOD5的值应在180～230 mg/L之间。否则应检查接种液、稀释水的质量或操作技术是合存在问题。
⑤水样稀释倍数超过100倍时，应须先在容量瓶中用水初步稀释后，再取适量进行最后稀释培养。
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