药物鉴别采用的方法应是专属性强、重现性好、灵敏度高并且操作简便、快速。常用的鉴别方法有化学法、光谱法和色谱法。
一、化学鉴别法
化学鉴别法的特点:反应迅速、现象明显、操作简便、成本低廉。不要求是否反应完全,只要发生反应即可。
1.呈色反应鉴别法
呈色反应鉴别法是指供试品溶液中加入适当的试剂溶液,在一定条件下进行反应,生成易于观测的有色产物。在鉴别试验中最为常用的呈色反应类型有以下几个。
(1)三氯化铁呈色反应:应用于含有酚羟基或水解后产生酚羟基的药物,如水杨酸及其盐。
(2)异羟肟酸铁反应:应用于含有芳酸、芳酸酯或酰胺的药物,如β-内酰胺类。
(3)茚三酮呈色反应:应用于含有脂肪氨基的药物,如氨基糖苷类。
(4)重氮化-偶合显色反应:应用于含有芳伯氨基或能产生芳伯氨基的药物,如奥沙西泮、贝诺酯。
(5)氧化还原显色反应:应用于能与氧化剂或还原剂发生反应而显色的药物,如盐酸氯丙嗪、肾上腺素。
(6)其他颜色反应:如维生素A。
2.沉淀生成反应鉴别法
沉淀生成反应鉴别法是指供试品溶液中加人适当的试剂溶液,在一定条件下进行反应,生成不同颜色或特殊形状的沉淀。
(1)与重金属离子的沉淀反应:在一定条件下,药物和重金属离子反应,生成不同形式的沉淀,如巴比妥类药物。
(2)与硫氰化铬胺(雷氏盐)的沉淀反应:应用于生物碱及其盐或具有芳香环的有机碱及其盐,如硫酸阿托品。
(3)其他沉淀反应:如维生素B1。
3.荧光反应鉴别法
常用的荧光发射形式有以下类型。
(1)药物本身可在可见光下发射荧光。
(2)药物溶液加硫酸使呈酸性后,在可见光下发射荧光,如苯并二氮杂类药物。
(3)药物和溴反应后,在可见光下发射荧光。
(4)药物和间苯二酚反应后,发射出荧光或药物经其他反应后发射荧光。
4.气体生成反应鉴别法
(1)大多数的胺(铵)类药物、酰脲类药物以及某些酰胺类药物,可经强碱处理后,加热,产生氨气,如普鲁卡因。
(2)化学结构中含硫的药物,可经强酸处理后,加热,产生硫化氢气体。
(3)含碘有机药物经直火加热,可生成紫色碘蒸气,如苯佐卡因。
(4)含醋酸酯和乙酰胺类药物,经硫酸水解后,加乙醇可产生乙酸乙酯的香味。
5.使试剂褪色的鉴别法
如司可巴比妥钠的碘试液反应。
6.测定生成物的熔点
如司可巴比妥鉴别项下要求“取本品1g,加水100mL溶解后,加稀醋酸5mL强力搅拌,再加水200mL,加热煮沸使溶解成澄清溶液(液面无油状物),放冷,静置待析出结晶,滤过,结晶在70℃干燥后,依法测定,熔点约为97℃”。
二、光谱鉴别法
1.紫外-可见光谱鉴别法
多数有机药物分子中含有能吸收紫外可见光的基团,从而显示特征吸收光谱,这是紫外-可见光谱鉴别法的依据。鉴别时一般采用对比法,按规定的方法配制供试品溶液与对照品溶液,通过对比吸收光谱的特征数据、吸收度或吸收系数、吸收光谱的一致性等进行鉴别。由于紫外-可见吸收光谱比较简单,光谱的曲线形状变化不大,专属性不如红外光谱,同一物质图谱相同,但图谱相同的却不一定为同一物质。但由于紫外-可见分光光度法比较方便,所以制剂的鉴别一般不采用红外分光光度法,而采用紫外-可见分光光度法。
紫外-可见分光光度法应用时,主要有以下几种方式。
(1)规定波长处最大或最小吸收,一般是特征吸收波长位置(λmax或λmin)。
如盐酸伪麻黄碱鉴别项下要求“取本品,加水制成每1mL中含0.5mg的溶液,照紫外-可见分光光度法测定,在251nm、267nm与263nm的波长处有最大吸收”。
如芬布芬鉴别项下要求“取本品,加无水乙醇制成每1mL中约含5μg的溶液,照紫外-可见分光光度法测定,在281nm的波长处有最大吸收,在238nm的波长处有最小吸收”。
(2)测定一定浓度的供试液在最大吸收波长处的吸光度。
如棕榈氯霉素鉴别项下要求“取本品,加无水乙醇溶解并定量稀释制成每1mL中含20μg的溶液,照紫外-可见分光光度法测定,在271nm波长处有最大吸收,其吸光度约为0.35”。
(3)吸收系数法:测定吸收波长,计算吸收系数。
如氢化可的松性状项下要求“取本品,精密称定,加无水乙醇溶解并定量稀释制成每1m.中约含10μg的溶液,照紫外-可见分光光度法,在242mm的波长处测定吸光度,吸收系数为422～448”。
(4)吸光度比值法:测定不同波长处的吸光度,比值在一定范围内。可以是吸收峰与吸收峰的比值,也可以是吸收峰与吸收谷的比值。
如丙酸倍氯米松鉴别项下要求“取本品,精密称定,加乙醇溶解并定量稀释制成每1mL中约含20μg的溶液,照紫外-可见分光光度法测定,在239nm的波长处有最大吸收,吸光度为0.57～0.60;在239nm与263nm的波长处的吸光度比值应为2.25～2.45”。
(5)样品经化学处理后,测定反应生成物的吸收光谱特性。
以上方法可以单个应用,为了提高鉴别的专属性,也可以几种方法结合起来使用,如丙酸倍氯米松的鉴别。
2.红外光谱鉴别法
红外光谱鉴别法是一种专属性很强、应用广泛的方法,主要用于组分单一、结构明确的原料药,特别是结构复杂、用其他常用方法不易区分的药物,并且适用于固体、液体甚至是气体的样品鉴别。
应用红外光谱进行鉴别试验时,药典采用标准图谱对照法。在药典规定的条件下测定供试品的图谱,然后与国家药典委员会编订的《药品红外光谱集》对照。
《药品红外光谱集》分卷出版,分别为第一卷(1995年出版)、第二卷(2000年出版)、第三卷(2005年出版)、第四卷(2010年出版)。每次新版中收载的药品红外光谱图包括新增品种和老品种重新绘制的图谱。所以,如果同一化合物的图谱在不同卷上均有收载时,用于鉴别时以后卷图谱作为比对依据,前卷光谱图仅作为参考。光谱图中的横坐标为波数(cm-1),纵坐标为透光率(T%)分辨率为2cm-1,基线一般控制在90%透光率以上,供试品取量一般控制在使其最强吸收峰在10%透光率以下。
原料药的鉴别除另有规定外,应按照《药品红外光谱集》各卷收载的各光谱图所规定方法制备样品。常用的制备方法有压片法、糊法、膜法、溶液法、衰减全反射法和气体法等。
组成相对稳定的多组分原料药鉴别不能采用全光谱比对,需参照原料药的标准光谱,在指纹区内选择主要成分的若干个特征谱带作为鉴别的依据。
制剂鉴别应按品种鉴别项下规定的前处理方法处理,通常是采用溶剂提取法。提取时应选择适宜的溶剂,尽可能减小辅料对鉴别结果的干扰,并且避免导致提取过程中药物晶型的转变。提取后的样品经适当干燥后依法进行鉴别。
在比对光谱时应注意以下儿点。
(1)辅料无干扰,待测成分的晶型不变化时,可直接与原料药的标准光谱进行比对。
(2)辅料无干扰,而待测成分的晶型有变化时,可用对照品经同法处理后的光谱比对。
(3)待测成分的晶型不变化,而辅料存在不同程度的干扰时,可参照原料药的标准光谱,在指纹区内选择3~5个不受辅料干扰的待测成分的特征谱带作为鉴别的依据。鉴别时,实测谱带的波数误差应小于规定值的0.5%。
(4)待测成分的晶型有变化,辅料也存在干扰,此种情况一般不宜采用红外光谱鉴别。
对照时一般先看最强峰的吸收位置、形状、数目等是否一致,然后再检查中等强度峰和弱吸收峰是否对应,如果供试品的红外光吸收图谱与对照品的图谱完全一致,一般可认为是同一种化合物(只有少数例外,如有些光学异构体或大分子同系物等)。若两光谱图不同,则可判定两化合物不同。但是在实际操作中由于绘制图谱时受药物粉末细度、吸水程度、试样的处理和制备等多种外界条件的影响较大,图谱易发生变异,因此在图谱对照时,要充分考虑各种因素可能造成的影响。
药典一般不单独用本法进行鉴别,常与其他理化方法联合进行鉴别。
如硫酸阿托品鉴别项下规定:①本品(试样制备:KBr压片法)的红外光吸收图谱应与对照的图谱(《药品红外光谱集》一致;②本品显托烷生物碱类的鉴别反应;③本品的水溶液显硫酸盐的鉴别反应。
三、色谱鉴别法
色谱鉴别法是指利用不同物质在不同的色谱条件下,比移值(Rf)或保留时间(tR)等是否一致来判定样品是否符合标准。因此,色谱法可用于多组分中的药物鉴别。
1.薄层色谱鉴别法
薄层色谱法鉴别原理为同一种药物在同样条件下的薄层色行为相同。一般采用对照品(或标准品)比较法,将供试品和对照品(或标准品)按药典规定,用同种溶剂配成同样浓度的溶液。在同一层板上点样、展开、显色,要求供试品斑点应与对照品(或标准品)斑点的位置(Rf)和颜色一致。薄层色谱法简单易行,适用于鉴别药物及其制剂的真伪;其应用范围日益扩大,特别是高效薄层色谱应用于中药鉴别方面。
在薄层色谱鉴别时需注意,点样基线距底边10～15mm,高效板一般基线离底边8～10mm。点样时小心,不要损伤薄层表面;点样的直径一般不大于3mm,高效板一般不大于2mm;点间距离可视斑点扩散情况调整,并保证相邻斑点互不干扰,一般不少于8mm,高效板供试品间隔不少于5mm。展开前如果需要溶剂蒸气预平衡,可在展开缸中加入适量的展开剂,密闭保持15～30min。溶剂蒸气预平衡后,迅速将点好供试品的薄层板放入展开缸中,进入展开剂的深度为距原点5mm为宜,展开剂不得没过原点,密闭,静置。除另有规定外,一般上行展开8～15cm,高效薄层板上行展开5～8cm。溶剂前沿达到规定的展距,取出薄层板,晾干,待检测。
供试品显色的方法:①含有可见光下有颜色的成分可直接在日光下检视,也可用喷雾法或浸渍法以适宜的显色剂显色,或加热显色,在日光下检视。②有荧光的物质或遇某些试剂可激发荧光的物质可在365nm紫外光灯下观察荧光色谱。③对于可见光下无色、但在紫外光下有吸收的成分可川荧光薄层板(如硅胶GF254板)检测,硅胶GF254板是在硅胶中掺入了少量荧光物质面制成的板,在254nm紫外灯下,整个薄层板呈黄绿色荧光,被测物质由于荧光猝火作用而呈现暗斑。
如葡萄糖酸钙鉴别项下要求“取本品50mg,加水5mL,温水浴溶解,滤过,取滤液作为供试品溶液。另取葡萄糖酸钙对照品,同法制成每1mL中含10mg的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法试验,吸取上述两种溶液各5μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以乙醇-水-浓氨溶液-乙酸乙酯(50:30:10:10)为展开剂,展开,晾干,置110℃加热20min后,放冷,喷以钼酸铵-硫酸铈试液(取钼酸铵2.5g,加1mol/L硫酸溶液50mL使溶解,再加硫酸铈1.0g,加1mol/L硫酸溶解并稀释至100mL,摇匀),再在110℃加热10min后,取出放冷,10min后检视。供试品溶液所显主斑点的位置和颜色应与对照品溶液的主斑点相同”。
2.高效液相色谱和气相色谱鉴别法
一般规定按供试品含量测定项下的高效液相色谱条件进行试验,要求供试品和对照品色谱峰的保留时间(tR)一致。含量测定方法为内标法时,要求供试品溶液和对照品溶液色谱图中药物峰的保留时间与内标物的保留试剂比值应相同。高效液相色谱和气相色谱鉴别法操作比较复杂,耗时长,一般在检查或含量测定项下已采用色谱法的情况下,才采用这两种方法做鉴别。
如紫杉醇鉴别项下要求“在含量测定项下的色谱图中,供试品溶液主峰的保留时间应与对照品溶液主峰的保留时间一致”。含量测定项下规定“取本品约12mg,精密称定,置100mL量瓶中,加乙腈溶解并稀释至刻度,摇匀,精密量取10μL注入液相色谱仪,记录色谱图;另取紫杉醇对照品,同法测定。按外标法以峰面积计算,即得”。
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