样品预处理之固相萃取法
固相萃取(solid phase extraction,SPE)是利用固体吸附剂将液体样品中的目标化合物吸附,与样品的基体和干扰化合物分离,然后再用洗脱液洗脱或加热解吸附,达到分离和富集目标化合物的目的。
固相萃取作为样品预处理技术,在实验室中得到了越来越广泛的应用。它利用分析物在不同介质中被吸附的能力差将目标物提纯,有效地将目标物与干扰组分分离,大大增强了对分析物特别是痕量分析物的检出能力,提高了被测样品的回收率。SPE 技术自20世纪70年代后期问世以来,发展迅速,广泛应用于环境、制药、临床医学、食品等领域。目前最多见其作为样品预处理的手段之一在药品及保健食品非法添加检测中的应用。
1、基本工艺与原理
固相萃取是一个包括液相和固相的物理萃取过程。在固相萃取中,固相对分离物的吸附力比溶解分离物的溶剂更大。当样品溶液通过吸附剂床时,分离物浓缩在其表面,其他样品成分通过吸附剂床;通过只吸附分离物而不吸附其他样品成分的吸附剂,可以得到高纯度和浓缩的分离物。
(1)保留与洗脱
在固相萃取中最常用的方法是将固体吸附剂装在一个针筒状柱子里,使样品溶液通过吸附剂床,样品中的化合物或通过吸附剂或保留在吸附剂上(依靠吸附剂对溶剂的相对吸附)。“保留”是一种存在于吸附剂和分离物分子间吸引的现象,造成当样品溶液通过吸附剂床时,分离物在吸附剂上不移动。保留是三个因素的作用:分离物、溶剂和吸附剂。所以,一个给定的分离物的保留行为在不同溶剂和吸附剂存在下是变化的。“洗脱”是一种保留在吸附剂上的分离物从吸附剂上去除的过程,这通过加入一种对分离物的吸引比吸附剂更强的溶剂来完成。
(2)容量和选择性
吸附剂的容量是在最优条件下,单位吸附剂的量能够保留一个强保留分离物的总量。不同键合硅胶吸附剂的容量变化范围很大。选择性是吸附剂区别分离物和其他样品基质化合物的能力,也就是说,保留分离物,去除其他样品化合物。一个高选择性吸附剂是从样品基质中仅保留分离物的吸附剂。吸附剂的选择性是三个参数的作用:分离物的化学结构、吸附剂的性质和样品基质的组成。
(3)分类
①正相固相萃取所用的吸附剂都是极性的,用来萃取(保留)极性物质。在正相萃取时目标化合物如何保留在吸附剂上,取决于目标化合物的极性官能团与吸附剂表面的极性官能团之间的相互作用,其中包括了氢键、π-π键相互作用、偶极-偶极相互作用和偶极-诱导偶极相互作用以及其他的极性-极性作用。
②反相固相萃取所用的吸附剂和目标化合物通常是非极性的或极性较弱的,主要是靠非极性-非极性相互作用,是范德华力或色散力。
③离子交换固相萃取是靠目标化合物与吸附剂之间的相互作用,是静电吸引力。
2、简要过程(如下图)
固相萃取的简要过程
(1)一个样品包括分离物和干扰物通过吸附剂;
(2)吸附剂选择性地保留分离物和一些干扰物,其他干扰物通过吸附剂;
(3)用适当的溶剂淋洗吸附剂,使先前保留的干扰物选择性地淋洗掉,分离物保留在吸附剂床上;
(4)纯化、浓缩的分离物从吸附剂上淋洗下来。
3、固相萃取技术的方法建立
(1)选择 SPE 小柱或滤膜
首先应根据待测物的理化性质和样品基质,选择对待测物有较强保留能力的固定相。若待测物带负电荷,可用阴离子交换填料,反之则用阳离子交换填料。若为中性待测物,可用反相填料萃取。SPE 小柱或滤膜的大小与规格应视样品中待测物的浓度大小而定。对于浓度较低的体内样品,一般应选用尽量少的固定相填料萃取较大体积的样品。
(2)活化
萃取前先用充满小柱的溶剂冲洗小柱或用 5～10mL 溶剂冲洗滤膜。一般可先用甲醇等水溶性有机溶剂冲洗填料,因为甲醇能润湿吸附剂表面,并渗透到非极性的硅胶键合相中,使硅胶更容易被水润湿,之后再加入水或缓冲液冲洗。加样前,应使 SPE 填料保持湿润,如果填料干燥会降低样品保留值;而各小柱的干燥程度不一,则会影响回收率的重现性。
(3)加样
①用0.1 mol/L 酸或碱调节,使 pH<3或 pH>9,离心取上层液萃取;
②用甲醇、乙腈等沉淀蛋白质后取上清液,以水或缓冲液稀释后萃取;
③用酸或无机盐沉淀蛋白质后取上清液,调节 pH 值后萃取;
④超声 15min 后加入水、缓冲液,取上清液萃取。尿液样品中的药物浓度较高,加样前先用水或缓冲液稀释,必要时可用酸、碱水解反应破坏药物与蛋白质的结合,然后萃取。流速应控制为2～4mL/min,流速快不利于待测物与固定相结合。
(4)清洗填料
反相 SPE 的清洗溶剂多为水或缓冲液,可在清洗液中加入少量有机溶剂、无机盐或调节 pH 值。加入小柱的清洗液应不超过一个小柱的容积,而 SPE 滤膜为5～10mL。
(5)洗脱待测物
应选用5～10mL 离子强度较弱但能洗下待测物的洗脱溶剂。若需较高灵敏度,则可先将洗脱液挥干后,再用流动相重组残留物后进样。体内样品洗脱后多含有水,可选用冷冻干燥法。保留能力较弱的 SPE 填料可用小体积、较弱的洗脱液洗下待测物,再用极性较强的 HPLC 分析柱如 C18 柱分析洗脱物。若待测物可电离,可调节 pH 值,抑制样品离子化,以增强待测物在反相 SPE 填料中的保留,洗脱时调节pH值使其离子化并用较弱的溶剂洗脱,收集洗脱液后再调节 pH 值使其在 HPLC 分析中达到最佳分离效果。在洗脱过程中应减慢流速,用两次小体积洗脱代替一次大体积洗脱,回收率更高。
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