引物的二次筛选是指在初次筛选出的几对引物中进一步筛选出适合我们进行特异、高效PCR扩增的那对引物。
本步应注意以下两点,一是得到的一系列引物分别在Genebank中进行回检。也就是把每条引物在比对工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/) 的blast nr中进行同源性检索,弃掉与基因组其它部分同源性比较高的引物,也就是有可能形成错配的引物。一般连续10 bp以上的同源有可能形成比较稳定的错配,特别是引物的3’端应避免连续5-6 bp的同源。
二是以mRNA为模板设计引物时要先利用生物信息学的知识大致判断外显子与内含子的剪接位点(例如http://CCR-081.mit.edu/GENESCAN.html的GENESCAN工具或者GeneParser软件,然后弃掉正好位于剪接位点的引物。
首页
