乙酰化是较常用的方法，芳香氨基化合物、酚类制成了乙酰化衍生物后，通过谱图中M-42来确认氨基和酚羟基的存在;脂肪族多羟基化合物制成的乙酰衍生物可以通过M-60来确认羟基的存在。在衍生化完全的情况下，通过衍生前后分子峰的比较可以确定化合物中NH2和OH的数目。图为海洛因的质谱图。图中与离子峰为m/z369，m/z327为m/z369-42，m/z 284为m/z 327-43，这海洛因的分子中有一个环羟基和一个酚羟基相一致。
分子中N和O上的氢被甲基取代称为甲基化，可以通过增加14个质量单位来辨认伯醇、仲醇或胺。糖类化合物有数个羟基，低聚糖内的糖基数目在有限的情况下，可以使用全乙酰化的方法进行衍生化。但是，糖基单元数目每增加1个，相应加3个OH，全乙酰化后则分子质量增加126u。多于4～5个糖基的低聚糖，分子质量已超过600u。
羟基数超过14个，预计全乙酰化后分子质量增加566u，整个衍生物的分子质量则超过1000u以上，这就是常用甲基化代替乙酰化的原因。甲基化不仅在衍生化后分子质量增加有限，而且容易实现全甲基化，尤其适合于糖蛋白中天线状的糖的衍生化。一种糖肽的全甲基化方法现叙述如下:100～200μg糖肽（如L-β-天冬酰胺-糖）溶于0.25mL干燥的二甲基亚砜中，加入0.2～0.25m Lmethylsulphonyl carbanion 溶液并搅拌2h。7μL碘代甲烷加入到反应液中，搅拌1h。减压蒸去反应混合物中残留的碘代甲烷。再次加入0.2～0.25mL methylsulphonyl carbanion 溶液，再搅拌1h，然后再加入70μL碘代甲烷，反应混合物连续搅拌6～7h。减压蒸去反应混合物中残留的碘代甲烷，加入0.7～0.8mL水。产物用 Sep-PakC18柱预处理，获得浓缩的产物溶液，再经 Sephadex LH-2柱纯化，得到全甲基化的糖肽，可供质谱分析。
一般双键也可以用质谱法测定。当化合物的元素组成式确定后，先求出环加双键值，然后将化合物进行氢化，根据氢化产物分子质量求出实际双键数目。由于重排反应原因，直接用质谱法测定其双键位置是很困难的。不过，利用衍生化的方法可以帮助确定双键的位置。
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