1、流动相
由于我国药品标准中没有规定柱的长度及填料的粒度,因此,每次开始检测新样品时几乎都须调整流动相(按经验,主峰一般调至保留时间为6～15min 为宜)。所以建议第一次检验时少配流动相,以免浪费。弱电解质的流动相其重现性更不容易达到,注意充分平衡柱。流动相滤过后,注意观察有无肉眼能看到的微粒、纤维;有则重新滤过。尽量采用不是弱电解质的甲醇-水流动相。
2、样品配制
塑料容器常含有高沸点的增塑剂,可能释放到样品溶液中造成污染,而且还会吸留某些药物,引起分析误差。某些药物特别是碱性药物会被玻璃容器表面吸附,影响样品中药物的定量回收,因此必要时应将玻璃容器进行硅烷化处理。
3、记录时间
第一次测定时,应先将空白溶剂、对照品溶液及供试品溶液各进一针,并尽量收集较长时间的图谱(如 30min 以上),以便确定样品中被分析组分峰的位置、分离度、理论塔板数及是否还有杂质峰在较长时间内才洗脱出来,确定是否会影响主峰的测定。
4、进样量
药品标准中常标明注入10μL,而目前多数 HPLC 系统采用定量环(10μL、20μL 和 50μL),因此应注意进样量是否一致(可改变样液浓度)。
5、计算
由于有些对照品标示含量的方式与样品标示量不同,有些是复合盐,有些含水量不同,有些是盐基不同,有些是采用有效部位标示,检验时请注意。
6、仪器的使用
(1)柱在线时,增加流速应以 0.2mL/min 的增量逐步进行,一般不超过1mL/min,反之亦然。否则会使柱床下塌,出现叉峰。柱不在线时,要加快流速也需以每次 0.5mL/min 的速率递增上去(或下来),勿急升(降),以免泵损坏。
(2)安装柱时,注意流向,接口处不要留有空隙。测定完毕用水冲柱1h,甲醇冲柱30min。如果第二天仍使用,可用水以低流速(0.1～0.3mL/min)冲洗过夜(注意水要够量),无须用甲醇冲洗。另外,需要特别注意的是:对于含碳量高、封尾充分的柱,应先用含5%～20%甲醇的水冲洗,再用纯甲醇冲洗。冲水的同时用水充分冲洗柱头(如有自动清洗装置系统,则应更换水或10%异丙醇)。
7、波长选择
首先在可见-紫外分光光度计上测量样品液的最大吸收光谱,以选择合适的测量波长,如最灵敏的测量波长并避开其他物质的干扰。从紫外光谱中还可大体知道在 HPLC 中的响应值,如吸光度小于0.5,HPLC 测定的面积将会很小。
首页
