患者女，30岁，主诉：声嘶2月余。职业为服装售卖员，四川成都人。2月余前患者感冒后出现发热（39.7℃）、头痛、咳嗽，2天后即出现声嘶。于当地诊所诊断“喉炎”，给予“氨苄青霉素”及“头孢克肟”（剂量不详，共6天），症状未减轻，声嘶较前加重。后患者就诊当地另外一家医院，给予“地塞米松”喉部局部注射，1周2次，共2周，仍无效，声嘶加重，伴有咳痰、呕吐。至我院耳鼻喉科就诊，给予纤维喉镜显示双侧假声带及真声带前三分之二肿胀增生伴有白膜（图1a，略）。左侧真声带活检显示组织中可见大量的45度角分枝菌丝，伴有中性粒细胞浸润。患者被推荐至我科进行真菌学检查及治疗。对患者再次进行纤维喉镜显示双侧真假声带均肿胀、增生、白膜（图1b，略）。取左侧真声带及右侧假声带组织。一部分经过10%KOH溶解后进行真菌镜检，镜下可以看到大量45度角分枝真菌菌丝（图1c，略）。另一部分于2%戊二醛固定，并进行扫描电镜观察（SEM； KYKY-2800，中国KYKY技术发展公司），发现大量真菌菌丝，一些45度角分枝真菌菌丝交织于组织中（图2e，略）。常规实验室检查包括血常规、胸平片、肝肾功能均正常，HIV抗体阴性。取左侧真声带及右侧假声带两处组织接种于SDA培养基28℃进行真菌培养，均显示松软的丝状菌落生长，初始为白色边缘，后期转变为深绿色边缘（图2b，略），背面为暗褐色。小培养（图2c，略）及SEM扫描（图2d，略）显示可见棒形孢子囊，似烧瓶状，紧密沿轴平行排列。分生孢子单层排列，分布于顶囊上三分之二，提示此菌为烟曲霉。
为进一步证实菌种，我们进行了DNA测序（参考Ran Y et al., Med Mycol 2008; 46: 475）。应用DNA提取试剂盒提取DNA，用引物ITS-1(5’-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G)及ITS-4(5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC)扩增基因ITS区域。扩增产物送上海Invitrogen公司纯化测序。序列应用CLUSTAL X软件进行对齐。两株菌显示具有同样的序列，进行BLAST基因比对显示ITS区与烟曲霉菌株IFM54307（EU693451）同源性100%。
两株真菌的胞外酶活性应用半定量Api-Zym系统（bioMerieux, Leon, France），按照说明书进行。酶活性的判读根据颜色变化深浅。结果显示两株菌具有相同的酶活性：碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、萘酚-AS-BI-水解酶、葡萄糖苷酶及N-乙酰-氨基葡糖苷酶显示比较强的活性，酯酶（C4）具有中等强度活性，亮氨酸芳基酰胺酶活性最弱（表1）。
表1 烟曲霉胞外酶活性分析结果
最终诊断为声带曲霉病，给予口服伊曲康唑胶囊（西安杨森制药中国有限公司）0.2g
bid。治疗7天后患者声嘶明显好转，纤维喉镜显示双侧真假声带水肿增生及白膜情况均较前明显减轻。治疗14天后，患者声音基本恢复正常，声带光滑，白膜消失（图1d，略）。右侧声带活检后一部分组织再次培养于SDA培养基上，培养4周未见真菌生长。另外一部分进行扫描电镜显示仅有一根受损的真菌菌丝见于组织中（图2f，略）。伊曲康唑减量至0.2g
qd巩固14天。经伊曲康唑治疗4周后，患者声带完全恢复正常，未见明显副作用。随访1年未见复发。
讨论
曲霉菌为机会感染性真菌，最常感染抵抗力低下的人群，但是感染声带者少见，尤其是免疫力正常者。大多为老年患者或者伴有疾病如糖尿病、糖皮质激素治疗、慢行阻塞性肺病、声带囊肿 、显著的CD4淋巴细胞下降或者外周T细胞淋巴瘤。一例6岁女童患有淋巴细胞白血病，感染可能与骨髓移植后应用免疫抑制剂有关。另一例2岁男童患有急性淋巴细胞性白血病。曲霉病容易感染免疫力低下的患者，尤其是伴有获得性免疫缺陷患者或者应用激素的患者
。然而也有报道感染免疫力正常患者病变局限于喉部，这可能与宿主局部免疫力降低或者当地环境温度及湿度有关。本例患者合并系统应用抗生素及局部应用糖皮质激素，这干扰了喉部正常菌群，降低了正常的防御机制，导致了声带的机会性感染及深部感染。
半定量胞外酶分析显示跟我们之前报道的病例是一致的。这些酶对于宿主的侵袭与定植非常重要。比如细胞外磷脂酶活性被报道是烟曲霉的毒力因素。但是此患者亮氨酸芳基酰胺酶活性比我们之前报道的病例较低。
患者的常规检查正常，无抽烟、饮酒史，但患者是一位服装售卖员，用嗓过度可能导致声带水肿，这可能是患者感染烟曲霉的一个原因。起初患者并没有得到正确诊断甚至应用了地塞米松，这些可能均导致真菌感染。因此对于声嘶的患者应该考虑到烟曲霉的可能，尤其是对于应用抗生素或者糖皮质激素治疗效果不好者。
既往报道喉部曲霉诊断仅仅依靠病损的活检，没有进行组织真菌培养或者菌种鉴定。我们通过组织病理、直接镜检、培养、扫描电镜、DNA测序鉴定为烟曲霉。患者应用伊曲康唑胶囊口服取得良好效果，并且通过纤维喉镜及扫描电镜得到了证实。
致谢：我们感谢患者对于病变取材及治疗的配合。此项目由高等学校博士学科点专项科研基金（20050610058）及国家自然科学基金（30570095）资助。
来源：Ran Y, Li L, Cao L, et al. Primary vocal cord aspergillosis and scanning electron microscopical observation of the focus of infection[J]. Mycoses, 2011, 54(5):e634-e637.
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