提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用0ligo (dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR 使测的灵敏性提高了几个数量级，使- - 些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于:分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。
(一)反转录酶的选择
1.Moloney鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶:有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37°C。
2.禽成髓细胞瘤病毒(AMV)反转录酶:有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42"C。
3. Thermus thermophi lus、Thermus flavus 等嗜热微生物的热稳定性反转录酶:在Mn2存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。
4. MMLV 反转录酶的RNase H- 突变体:商品名为SuperScript和SuperScript II。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含 二级结构的、低温反转录很困难的m模板合成较长cDNA。
(二)合成cDNA引物的选择
1.随机六聚体引物:当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这-不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA 第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。
2. 0ligo(dT): 是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A )尾，此引物与其配对，仅mRNA被转录。由于Poly(A )RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量
3.特异性引物:最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3’端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。生物科研www. biom. cn
二、实验耗材与试剂
1. RNA 提取”target="_ blank" >RNA 取试剂
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