反相色谱(RPC)是指利用非极性的反相介质为固定相,极性有机溶剂的水溶液为流动相,根据溶质极性(疏水性)的差别进行溶质分离与纯化的洗脱色谱法。与HIC一样,RPC中溶质也通过疏水性相互作用分配于固定相表面,但是,RPC固定相表面完全被非极性基团所覆盖,表现出强烈的疏水性。因此,必须用极性有机溶剂(如甲醇、乙腈等)或其水溶液进行溶质的洗脱分离。
溶质在反相介质上的分配系数取决于溶质的疏水性,一般疏水性越大,分配系数越大。当固定相一定时,可以通过调节流动相的组成调整溶质的分配系数。RPC主要应用于相对分子质量低于5000,特别是1000以下的非极性小分子物质的分析和纯化,也可以用于蛋白质等生物大分子的分析和纯化。由于反相介质表面为强烈疏水性,并且流动相为低极性的有机溶剂,生物活性大分子在RPC分离过程中容易变性失活,所以,以回收生物活性蛋白质为目的时,应注意选用适宜的反相介质。
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