细菌产生灭活的抗菌药物酶使抗菌药物失活是耐药性产生的最重要机制之一，使抗菌药物作用于细菌之前即被酶破坏而失去抗菌作用。这些灭活酶可由质粒和染色体基因表达。β-内酰胺酶：由染色体或质粒介导。对β-内酰胺类抗生素耐药，使β-内酰胺环裂解而使该抗生素丧失抗菌作用。β-内酰胺酶的类型随着新抗生素在临床的应用迅速增长，详细机制见β-内酰胺类抗生素章。氨基苷类抗生素钝化酶：细菌在接触到氨基苷类抗生素后产生钝化酶使后者失去抗菌作用，常见的氨基苷类钝化酶有乙酰化酶、腺苷化酶和磷酸化酶，这些酶的基因经质粒介导合成，可以将乙酰基、腺苷酰基和磷酰基连接到氨基苷类的氨基或羟基上，使氨基甘类的结构改变而失去抗菌活性；其他酶类：细菌可产生氯霉素乙酰转移酶灭活氯霉素；产生酯酶灭活大环内酯类抗生素；金黄色葡糖球菌产生核苷转移酶灭活林可霉素。
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