1、RNA切割作用
脱氧核酶最重要的一种性质，也是目前研究最活跃的一个方面，是具有通过酯化作用而切割RNA分子的功能。DNA这种独特的性质，使其有可能应用于破坏体内细胞和病毒的RNA，具有潜在的体内治疗作用。脱氧核酶发挥RNA切割作用有以下几种形式：
（1）以金属离子为辅因子：用“催化洗脱”的方法从一个随机序列库中筛选出一系列二价金属离子依赖的具有 RNA切割作用的脱氧核酶，分别以Mg2+、Pb2+、Zn2+、Mn2+等作为辅因子。使用Ca2+、Cd2+为辅因子，同样筛选出具有RNA切割作用的脱氧核酶，扩展了金属辅因子的范围。每一种结构脱氧核酶依赖的二价金属离子种类和程度都有差别，具有特异性，这种特异性表明脱氧核酶存在一个或几个对几何形状和大小尺寸有严格要求的金属离子结合位点。金属离子的作用可能是促进DNA正确折叠以形成催化中心，保持脱氧核酶处于活性状态，稳定反应物的中间过渡态，以及屏蔽寡核苷酸所带的负电荷，以利于酶与RNA底物杂交等。另外，三价的稀土元素镧系金属离子（铽、铥、镧）也可作为辅因子，协助脱氧核酶空间折叠和发挥催化作用。特别已筛选出的两个Mg2+依赖的脱氧核酶，能切割所有RNA底物，分别命名为“8-17”和“10-23”，都由结合部位和催化部位组成，结合部位通过Watson-Crick碱基配对与底物RNA分子结合，而催化部位在RNA分子的一个未配对的嘌呤和一个已配对的嘧啶碱基处切割RNA，改变结合部位的碱基序列就可作用于不同底物RNA靶分子。
（2）以氨基酸为辅因子：除了金属辅因子外，脱氧核酶还可利用氨基酸作为辅因子。筛选出了一个以L-组氨酸为辅因子的脱氧核酶，只有在L-组氨酸存在的条件下才发挥RNA切割作用，而D-组氨酸不能有效促进脱氧核酶的切割功能，说明DNA 能够形成精确的空间结构以识别底物分子和辅因子。组氨酸作为一般碱催化剂起着独特作用，起主要作用的是分子内的咪唑基团。另外精胺也可作为辅助因子，依赖精胺的脱氧核酶的切割机制与锤头状核酶相似，产生游离的5′-OH和2′,3′-环磷酸基团。
（3）自身具有RNA切割作用：不需要任何辅因子，单链DNA分子依靠自身的结构变化也具有RNA切割作用。已用二价金属离子螯合剂EDTA排除二价金属离子的污染，并进行准确的微量金属分析，在确认没有二价金属离子或其他适合辅因子存在的条件下，通过“催化洗脱”的方法筛选到一个具有RNA切割作用的脱氧核酶，命名为 “G3”。与不加酶的反应相比，它提高催化效率108倍。此研究表明DNA分子自身也能提供具有活性的化学基团而发挥催化效应。
2、DNA切割作用
脱氧核酶不仅具有RNA切割作用，而且也能切割DNA 分子。已筛选出了两类具有DNA自我切割作用的脱氧核酶，Ⅰ类自我切割脱氧核酶需要Cu2+和维生素C参与，而Ⅱ类脱氧核酶只需要Cu2+。Ⅱ类脱氧核酶以顺式方式切割DNA靶分子，与不加酶的反应相比，它提高催化效率106倍。多数脱氧核酶只能与底物形成二联体形式，而Ⅱ类脱氧核酶能与底物形成二联体或三联体形式，结合并切割DNA底物，通过改变二联体或三联体的识别位点，就可以切割不同核苷酸序列的单链DNA分子。因此脱氧核酶还可以作为简单的限制性内切酶，位点特异性地切割单链 DNA分子。
3、卟啉金属螯合作用和过氧化物酶活性
已筛选出一个只有24 nt富含鸟嘌呤G的脱氧核酶“PS5M”，PS5M形成一个G四聚体结构的催化活性中心，结合一个扭曲的卟啉分子，使卟啉分子类似于金属螯合反应的中间过渡态，从而促进了金属的螯合作用，PS5M还能与血红素结合，形成的复合物具有过氧化物酶活性，能催化氯高铁血红素-氢过氧化物的分解。
4、DNA激酶活性
脱氧核酶还具有DNA激酶活性，类似T4多核苷酸激酶的作用，能把NTP或dNTP上的γ-磷酸基团转移到DNA的5′-OH上。从一个随机单链DNA库中筛选出50个不同序列类型的具有自我磷酸化作用的脱氧核酶，都能把NTP或dNTP上的γ-磷酸基团转移到DNA的5′-OH上，实现DNA分子5′-OH端自我磷酸化。通过优化反应条件，脱氧核酶还能区分NTP和dNTP，其中一个优化的ATP依赖的脱氧核酶能特异性地选择ATP，高出CTP、GTP及UTP 4000倍，相对于不加酶的ATP水解反应，脱氧核酶提高催化效率106倍。
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