脱氧核酶还具有DNA激酶活性，类似T4多核苷酸激酶的作用，能把NTP或dNTP上的γ-磷酸基团转移到DNA的5′-OH上。从一个随机单链DNA库中筛选出50个不同序列类型的具有自我磷酸化作用的脱氧核酶，都能把NTP或dNTP上的γ-磷酸基团转移到DNA的5′-OH上，实现DNA分子5′-OH端自我磷酸化。通过优化反应条件，脱氧核酶还能区分NTP和dNTP，其中一个优化的ATP依赖的脱氧核酶能特异性地选择ATP，高出CTP、GTP及UTP 4000倍，相对于不加酶的ATP水解反应，脱氧核酶提高催化效率106倍。
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