分离培养是Cpn特异性实验室诊断方法，可用鼻咽或喉拭子、痰和胸腔积液标本分离Cpn，鼻咽部拭子是进行分离的理想标本，喉和痰液分离Cpn有何差别还不清楚。Cpn需要在组织中进行培养，无细胞培养基不适合Cpn繁殖，Cpn能在呼吸道来源的细胞系如：HEp-2和HL细胞系中稳定生长。拭子采用涤棉、金属线为好，拭子既应注意防污染，亦要防止细胞和Cpn受抑制，取得的标本通常置于加抗生素和小牛血清的蔗糖磷酸缓冲液（保存于4℃，不超过24h），标本置于室温会降低其活性，如果不能在24h内处理，标本应置于−70℃冰箱保存。接种后72h，要证实菌株，可用Cpn特异性或衣原体种特异性（即抗LPS）荧光结合单克隆抗体进行染色。Cpn包涵体不包含糖原，因此不被碘染色。
但是，肺炎衣原体的组织培养较其他衣原体困难，在作分离培养时，常采取以下措施以增强肺炎衣原体的感染性及促进其在细胞中的生长：
①接种物离心（3000r/min）。
②培养细胞用30µg/ml的二乙氨基乙基葡聚糖（DEAE-dextran）预处理。
③加入细胞生长抑制剂，如环己酞亚胺1µg/ml以抑制宿主细胞生长。Kuo等在研究肺炎衣原体培养所需氨基酸时发现，赖氨酸和蛋氨酸的部分或完全缺失可不同程度地促进肺炎衣原体的生长，但该促进作用在加入环己酞亚胺后变得不明显。Theunissen等观察了SPG保存液的pH、离子强度、温度对肺炎衣原体感染HL细胞的影响，发现pH大于8或小于5，原体的存活率迅速减低；在含10%小牛血清的SPG中，外加NaCI浓度小于80mmol/L时原体的活性受到影响，而0.346～4mmol/L的Ca2+或0～2.5mmol/L的Mg2+对原体感染性的影响不明显；在0～20℃24h内，SPG中原体95%以上存活，温度超过20℃，原体的存活率随存放时间的延长下降迅速。
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