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对双链DNA、双链RNA和DNA-RNA杂交体相对不敏感。通常水解单链DNA的速率要比水解双链DNA快75000倍。这种酶需要低水平的Zn2+的激活，最适pH范围为4.0～4.3。一些螯合剂(如EDTA和柠檬酸等)能强烈地抑制S1核酸酶活性，此外磷酸缓冲液和0.6%左右的SDS溶液也可以抑制它的活性，但它对尿素以及甲酰胺等试剂则是稳定的。
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