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行使功能的microRNA成熟形式一般仅18——25nt,因此在逆转录环节通过特定引物增加其长度,以便于qPCR过程正常进行。
颈环法中的逆转录引物由自身可形成颈环结构的通用序列加上目的microRNA 3’端碱基的反向互补序列;
polyA加尾法即在逆转录前先加polyA尾,然后通过oligo(dT)引物进行逆转录。
方法设计及实验成本均高于加尾法,但在检测灵敏度及特异性方面具有优势。