基因组重排技术大致的过程可分为突变体库的构建、原生质体融合与融合子筛选、递归原生质体融合三个基本环节。
首先需要对常规的菌种进行传统诱变从而建立突变体库,诱变的方式有紫外诱变、X射线诱变、化学诱变剂诱变等,其诱变依然有其不定向性。因此要在此基础上筛选拥有较优良性状的菌株构建突变体库。
接下来是原生质体的融合,融合之前首先需要进行原生质体的制备。微生物原生质体的制备关键是对细胞壁的消化。目前,制备原生质体大都是利用酶解法脱去细胞壁。但由于各种微生物细胞壁组成迥异,制备原生质体的条件也各不相同。比如,在制备细菌、放线菌的原生质体时,主要使用溶菌酶作为工具酶。而对于酵母菌等真菌时,使用酶复合物或商品酶的混合液比单独使用一种酶的效果好。
而原生质体的融合方法主要分为电击融合等物理手段或者PEG诱导的化学手段。电融合是以空间定向,时间同步的可控方式来实现原生质体的融合,其融合频率高,对细胞损伤较小。PEG则是一种表面活性剂,加入后会提高融合频率,但PEG的浓度必须处于一个特定的范围之后,否则会对细胞造成损伤。另外融合时间、融合温度、融合菌株之间的亲和力对融合效率都有影响。在融合结束时将获得的原生质融合体离心,洗涤,重悬于缓冲液中,连续稀释并在再生培养基上再生,获得菌株并进行下一轮融合,重复几轮直至获得所需的菌株。
之后需要进行融合子的筛选,根据筛选目的不同,筛选的方式也各不相同。筛选高产的目的菌株时,主要依靠产物的物理和化学性质,如在琼脂培养基上的抑菌圈、透明圈及水解圈等。筛选对某物质具有抗性的目的菌株时,则可以利用相应的选择培养基。此外还有一种筛选方法是亲本原生质体的灭活,该方法常用的两种灭活标记主要分为单亲灭活标记和双亲灭活标记,如果亲本用一种灭活方式,由于损伤的位点可能相同,所以很难通过融合来再生,如果用两种不同的方式灭活,那么受损的部位不同,这样通过融合修复受损的部位在再生平板上就可以再生,双亲灭活是一种高效可靠的筛选标记,省却了双亲的遗传标记,提高了融合效率。
最后一步即为递归融合,递归融合即从首轮重排的融合子中选出性状得到改进的融合子作为下一轮的亲本,将其制成原生质体再进行融合,重复以上步骤直至得到理想的融合子。
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