实验室诊断最好的方法是分离培养、检测解脲脲原体抗原或核酸成分。注意采集新鲜标本（精液、前列腺液、阴道分泌物、尿液等）并立即接种。若不能立即接种，应将标本放4℃冰箱保存，在12h内接种。解脲脲原体的分解可用加尿素和酚红的含血清支原体肉汤。肉汤内可加青霉素抑制杂菌生长。解脲脲原体具有尿素酶，可分解尿素产生氨，使培养液中酚红变红，但培养液澄清不出现浑浊，表示阳性。在固体培养基上用低倍镜显微镜观察，可见有微小的油煎蛋样或颗粒样菌落生长。免疫斑点试验（IDT)或ELISA法可用于检测解脲脲原体抗原或鉴定解脲脲原体培养物。
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