克隆化酵母DNA的操作实验——穿梭质粒

1.  构建其必需基因的染色体拷贝已被破坏的单倍体菌株，及带有完整的必需基因和URA3选择标志的YEp质粒。

2.  将必需基因亚克隆到YCp载体（带有URA3以外的选择标志），取约10~20 μg 用羟胺或其他技术进行诱变。

3.  转化至步骤1的菌株中，在添加了尿嘧啶的省却成分平极上，选择YCp质粒，于允许温度下培养（通常为25℃）。

4.  将每一个转化平板影印到两个带有5-FOA并能选择YCp载体的平板上，其中一个平板于允许温度下培养，另一个于非允许温度下培养（通常为36℃）。

5.  选取在允许温度而不是非允许温度下出现乳头状菌落，从转化平板上回收这些 菌落，并划线分离单茵落。

6.  在两种温度下从每一个待检测Ura^- 乳头状菌落中重复检测大约6个单菌落，作为对照，在两种温度下用平板培养，以排除无关染色体的温度敏感突变，对于每一个经过重复检验的温度敏感突变，从培养于允许温度下的5-FOA平板上回收Ura^- 乳头状菌落（在另一个对YCp载体保持选择压力的平板上划线分离），通过转化大肠杆菌从这些菌株中回收质粒（现在只含有YCp载体）。

7.  将基因（现在带有ts突变）亚克隆到YIp5的载体并应用移换技术将此突变基因引入染色体位点。