肌肽
L-Carnosine
MW：226.23
鹅肌肽
L-Anserine
MW：240.26
肌肽（β-丙氨酰-L-组氨酸，L-Carnosine），是由β-丙氨酸和L-组氨酸两种氨基酸组成的二肽；鹅肌肽（β-丙氨酰-1-甲基-L-组氨酸，Anserine），为高度稳定的水溶性二肽，天然存在于脊椎动物的骨骼肌组织和脑组织中。
客户提供了肌肽和鹅肌肽单标，希望本实验室建立液相分离方法。
由于肌肽和鹅肌肽二者结构只相差一个甲基，极性差异较小，因此分离难度相对较大。实验室的小伙伴尝试了多款色谱柱进行分析尝试，你猜最后谁赢了？下面就来看看吧~
酸性+纯水相
首先，尝试使用键合立体笼状结构金刚烷基官能团的高表面极性色谱柱——CAPCELL PAK ADME，在酸性纯水相条件下进行分析，发现肌肽和鹅肌肽出现分离趋势，但由于保留时间较短，无法达到有效分离，结果如图1所示。
▲图1 CAPCELL PAK ADME在酸性条件下分析结果
TFA+纯水相
为了延长保留时间，将0.1%磷酸水溶液更换为0.1%三氟乙酸（TFA）水溶液，使用耐纯水的高极性色谱柱——CAPCELL PAK C18 AQ色谱柱进行分析，希望能在离子对试剂的作用下加强保留。
如图2，TFA条件下保留时间延长至4min，但分离趋势减弱；同时我们也将离子对试剂更换为辛烷磺酸钠，进一步延长了保留时间，但同样分离趋势不明显。
▲图2 CAPCELL PAK C18 AQ色谱柱在TFA条件下分析结果
HILIC模式
由于在酸性反相条件下保留时间较短未能得到分离，因此也考虑尝试使用HILIC模式加强保留。使用PC HILIC色谱柱在80%乙腈条件下进行分析，结果如图3所示，肌肽保留时间能够延长至10 min以上，但峰形较宽，无法得到二者分离。
▲图3 PC HILIC色谱柱分析结果
碱性+纯水相
综合考虑上述分析结果后，继续尝试在碱性条件（pH 9.0）使用反相色谱柱进行分析。由于流动相条件碱性较强，且不含有机相，因此首先使用了耐碱性较强的CAPCELL PAK C18 BB色谱柱进行尝试，如图4，在碱性条件下肌肽和鹅肌肽保留时间较长，且分离良好。
▲图4 CAPCELL PAK C18 BB在碱性条件下分析结果
中性+纯水相
然而，考虑到碱性的纯水相条件非常苛刻，即使使用耐碱性色谱柱进行分析，仍可能对色谱柱自身寿命造成不良影响，因此我们进一步尝试将流动相条件由碱性调整为中性，同时比较耐碱型色谱柱BB和耐水型色谱柱AQ的分析结果。如图5，在中性条件下，耐水型色谱柱AQ的保留及分离情况要优于BB色谱柱。
▲图5 中性条件下CAPCELL PAK C18 BB与AQ色谱柱分析结果对比
中性+高水相
最终，我们选择CAPCELL PAK C18 AQ色谱柱在中性分析条件下添加5%甲醇，同时优化柱温，得到最终分析结果如图6所示，肌肽与鹅肌肽之间分离度为2.82，能够达到基线分离。
▲图6 CAPCELL PAK C18 AQ色谱柱优化条件分析结果
注：峰上标数字为分离度。
综上所述，经过一系列色谱条件的调整和色谱柱的筛选，最终，使用能在纯水相条件下稳定使用的高极性色谱柱CAPCELL PAK C18 AQ S5; 4.6 mm i.d. × 250 mm在中性高水相条件下可完成肌肽和鹅肌肽的良好保留与基线分离；实际样品分离过程中，客户可根据实际需要再做pH调整等措施来改善分离及保留。
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