这个问题，答案是肯定的，在相同的粒径条件下，反相的纯化效果往往都会优于正相。那么该什么时候选择反相纯化呢，或许这个问题更值得我们探究和讨论
当反应体系的极性变大时，传统的正相分离会变得越来越低效，遇到这种情况时，我们往往需要求助于使用新的极性更大的流动相：DCM +MeOH，但二氯甲醇的溶剂组合往往会给纯化带来更多的不可预知性，轻微的溶剂比例的调整往往会造成糟糕的纯化结果。下图为对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸甲酯、4-甲基-5-硝基咪唑的分离谱图，由于甲醇的强极性，导致其中两个样品完全没有得到分离；
Figure 1. DCM +MeOH条件下的样品分离
所以很多情况下，二氯甲醇并不是首选的流动相选项；我们会推荐您选用反相纯化体系。
在硅胶发展成常规填料之后的几十年里，反相硅胶填料（C4，C8，C18）也已经变得非常成熟，成为了分离纯化的中坚力量，发挥着不可或缺的关键作用。尽管如此，很多化学家们在考虑进行反相制备的选择时，仍然有一些顾虑，主要原因有两个：第一，纯化后的馏分溶剂沸点较高，需要更长时间进行溶剂处理；第二，需要重新购买一台专门用于反相纯化的制备液相，增加了更多的成本；这两方面的顾虑，导致了反相分离的应用被缩减了很多。
以上两种问题，Biotage都可以为您提供适配的解决方案，Biotage V-10 Touch可以为您解决高沸点溶剂处理难题，即使是100%纯水都可以轻松应对；另外对于需要购置专门的反相制备而言，全新的Selekt系统独家双通道设计，可以同时支持正反相分离纯化，解决您的仪器后顾之忧。
那么，客观条件解决后，我们回到原来的问题：该什么时候选择反相纯化呢？
首先，我们来浅谈一下正反相之间分离机理的差别。
正相分离主要以硅胶和氧化铝作为固定相相填料，根据分子极性的不同，通过分子间作用力，进行吸附和解吸附；而当样品化合物的极性过大时，化合物和固定相之间的作用力就会明显增大，我们需要使用更强的极性溶剂才能将样品洗脱下来，所以在设定方法的时候，都是通过由弱变强的梯度设定进行洗脱。当分子极性强度增加到一定程度的时候，当前的流动相已经无法将此类分子洗脱下来，需要更换极性更强的一组溶剂进行洗脱，也就是我们常见的将正己烷-乙酸乙酯体系更换成二氯甲烷-甲醇体系，但是当使用二氯甲烷-甲醇体系的时候，由于甲醇的强极性会导致：即使溶剂比例的微小变化也会使得多个样品同时洗脱出来，没有得到分离，出现了刚刚上图的问题。
当然，我们也可以通过再次改变流动相溶剂来寻找最佳的分离条件。当我们将强极性的甲醇改成乙腈时，分离效果得到了明显改善，如下图：
Figure 2. DCM-ACN 分离谱图。
如果您坚持进行正相分离，这是一个很好的改进思路，但这样的分离效果并不理想。
说完正相体系之后，我们来讨论一下反相体系，其机理和液液萃取的原理类似，样品通过在有机相和水相之间的分配系数的不同达到不同的分离效果，化合物会通过疏水作用进入到有机相当中，随着在梯度洗脱中有机相浓度的增加，化合物的动力学分配也会随之发生变化，疏水作用越强的化合物，保留时间越长，所需要的溶剂比例也会越强。
在最近的实验当中，我们将以上正相体系中未分开的两种化合物（下图为对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸甲酯）进行了正相和反相的分离对比实验，两种化合物结构如下：
Figure 3. 对羟基苯甲酸丁酯和对羟基苯甲酸甲酯在于丁基和甲基的区别，极性很相似，但是疏水性质却不同
正相条件下：我们进行了TLC条件摸索，在20%的溶剂比例下，两种样品的Rf值分别为0.38 (丁基-) 和 0.30 (甲基-)，在Selekt软件下，输入相关TLC点板信息，系统会自动生成梯度方法，如下：
Figure 4. Selekt梯度方法操作界面
仪器：Biotage Selekt System（可同时支持正反相分离）
样品：100mg
色谱柱： 5g 20 µm Biotage® Sfär 色谱柱
分离后，谱图如下：
Figure 5. 对羟基苯甲酸丁酯和对羟基苯甲酸甲酯通过5g 20 µm Biotage® Sfär 色谱柱正相分离谱图。
即使使用了20um的全球性硅胶柱，这两个样品仍然存在一些交叉污染。
从理论角度来看，由于甲基和丁基之间疏水性的差异，反相的分离效果会比正相更好，以下为反相分离的实验数据：
仪器：Biotage Selekt System（可同时支持正反相分离）
样品量：100mg
方法：50%MeOH/H2O - 100% MeOH/H2O 10CV
色谱柱：6g，30 µm Biotage® Sfär C18 column
分离后得到的谱图如下：
Figure 6. 对羟基苯甲酸丁酯和对羟基苯甲酸甲酯通过6g，30 µm Biotage®Sfär C18 column 色谱柱反相分离谱图
此样品在反相条件下，分离效果比正相更好，可以发现反相的分离效果往往比正相分离更加优秀，尤其是对于一些强极性样品以及一些疏水性有差异的样品。
在此，我向大家建议，在遇到正相分离效果不佳的情况下，大家可以尽量多的尝试一些反相分离。
如您有任何疑问，欢迎您留言给我们反馈和建议。
首页
