Flash，又名快速色谱，在上个世纪刚刚面世之时，几乎所有的应用都是以正相硅胶为主，而近些年来，反相Flash的应用正变得越来越炙手可热，在过去的十几年里，Flash的反相应用增长了650%！能有如此高数字的涨幅是非常了不起的，要知道单根反相Flash色谱柱的成本是常规正相色谱柱的十倍以上，同时反相方法收集所得的馏分也比正相含有水相，沸点更高，更难进行蒸发浓缩。有如此多的不便利，为什么其使用率却是越来越高呢？是什么推动这个趋势的发展的呢?
今天我们将为您剖析一下造成这种发展趋势的原因。
从历史发展角度来看，在合成化学领域，反相色谱技术往往是被认为是分析HPLC的专属，大部分的用户都是在最终产物，中间体或者杂质检测时，才会接触到反相色谱；所以在最初的应用领域，分析级别的反相HPLC方法是应用最集中的位置。而在合成实验室，对于大部分小分子化合物而言，通过成本最低的正相硅胶即可解决在合成实验室中绝大多数的纯化问题，但由于精度以及所需实验的纯度测试要求，往往在合成的过程中都需要对中间体或者最终产物进行纯度测试或者进一步的精纯，这时候高压的HPLC就派上用场了，由于和正相相比，反相方法具有应用范围广，色谱柱可反复使用等特点，随着技术的发展、成本的降低以及更多极性样品的纯化需求，反相的纯化技术得到了更大范围的应用。
同时在Flash应用领域，也出现了这种趋势，尽管在合成化学领域，化学家们只需要在规定的纯度要求下，快速的得到所需目标化合物，但反相Flash制备纯化的应用仍然如雨后春笋一般，在全球各地得到大量的应用和发展。
在不断的向反相转移的一些原因如下：
越来越复杂的化合物设计和反应体系（副产物难去除）
越来越多的极性化合物的合成
越来越注重对环境的影响/绿色化学
减少有机溶剂的使用
增加色谱柱重复使用率（减少固废处理以及降低成本）
减少耗材消耗（溶剂和色谱柱等）
下面我们将通过一个实际案例来说明这些原因，如下图，产物为碱性极性类化合物，使用正相方法可能引起拖尾或者死吸附。
图 1. 3-benzyl-2-phenyl-2,3-dihydro-4(1H)-quinazolinone的合成,分子量314.
为了解反应体系中各组分极性大小以及相关性质，我们通过TLC薄层板进行了极性测试，如图2。通过TLC的相关信息，我们建立了对应的分离方法。
图 2. TLC点板信息，展开剂极性：40% 乙酸乙酯/正己烷，反应产物是深色的蓝色斑点，紧接着后面有拖尾副产物。
同时我们还通过Dalton 2000对体系进行了质谱分析，产物质谱峰为：+m/z314.8 和 –m/z of 312.8)，还有一些其他的杂质峰为:+m/z 235.4 和 +m/z 226.8.
在了解了整个体系的性质之后，我们首先进行了正相分离方法的尝试，将30mg的粗品干法拌样后使用一根5g 的20um高柱效色谱柱进行分离，梯度方法从10%升高至80%，得到如下分离谱图：
图 3. 正相分离谱图
从谱图分析，发现产物和杂质几乎同时出峰，交叉污染比较明显，考虑其原因应该是杂质和产物的急性很相似，和正相的吸附能力都很强，导致其之间没有分离度，此时我们准备考虑尝试进行反相分离。
由于反相拥有完全不同的分离机理，是通过化合物疏水性质的不同，样品会在水相和有机相之间进行不同程度的分配，又由于固定相碳链的保护，导致反相所适用的范围更加广泛，不会产生死吸附等问题；即使极性相同，只要疏水性有差异，都可以得到很大的分离效果；想到就需要行动，因此我们准备进行反相分离尝试。
所使用色谱柱为 6g Biotage® Sfär C18色谱柱，流动相为水和乙腈，也是同样干法上样后进行分离，梯度范围为50%-80%，得到如下分离谱图：
图 4. 反相分离谱图
在反相分离中，杂质226和目标产物314得到了完美的分离，他们之间的出峰顺序也和我们正相当中截然不同。
从以上的案例分析可以发现，当您在正相分离过程中遇到一些瓶颈时，反相分离的尝试或许会给您打开另一道成功的大门；从目前的使用情况而言，虽然反相色谱柱的成本相对来说更高，但由于其可反复使用，更加环保，往往柱效也会更高；因此其应用的程度将会越来越广泛而深入。
如您对Flash纯化也感兴趣，欢迎和我们讨论并分享您的见解。
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