11月17日，施一公团队在《细胞》再次发表剪接体结构最新成果，电镜数据采自清华大学冷冻电镜平台，这项技术获今年化学诺奖。来看记者探访。
文/记者 吉菁菁 摄影/张星海
新媒体编辑/陈炫之
▲清华大学生命科学馆-冷冻电镜平台所在地
“我们这几台冷冻电镜全都是满负荷运行，除去定期升温保养的时间，一年 365 天，包括春节假期，24 小时运转不停。”
北京深秋的一个周一下午，身处清华大学生命科学馆一楼，站在一个和面前“身长”4 米、“身形”至为雄伟的 Titan Krios 300 千伏冷冻电镜 相比稍显拥挤的房间内，中国国家蛋白质科学研究（北京）设施清华大学冷冻电镜平台总管雷建林介绍说。
▲Titan Krios 300千伏冷冻电镜外观至为雄伟
他口中的“这几台冷冻电镜”，是目前世界上最先进的高分辨场发射冷冻透射电镜，由Thermo Fisher（当时的 FEI 公司）生产，目前全世界范围内安装完成不超过 100 台，而清华大学冷冻电镜平台就拥有其中的 3 台。
仅仅从外形来看，矗立在房间中“立地顶天”的 Titan Krios 电镜是一个名副其实的“泰坦巨人”。为了保证电子可以穿透厚样品，价格昂贵的显微镜加速电压非常高。
超高的加速电压也带来了巨大的显微镜，导致安装时对环境的要求非常严格，因为承重和防震的原因往往只能放在楼内最底层。也正因为这个原因，另外 2 台“泰坦巨人”被安放在生命科学馆院子中加盖的地下一层中。
▲Titan Krios 300千伏冷冻电镜内部构造，超高的加速电压也带来了巨大的显微镜
平台总管雷建林同时是清华大学生命科学学院研究员、凝聚态物理专业博士，在刚刚结束的第十五次中国暨国际生物物理大会获得首届中国冷冻电镜杰出贡献奖。 2008 年 11 月，雷建林离开美国哥伦比亚大学 Joachim Frank教授（2017 年诺贝尔化学奖得主）的实验室，回国任筹建中的清华大学冷冻电镜平台总管，参与并亲证了这个目前中国最顶尖、亦是全球最一流的冷冻电镜平台之一从成立到发展壮大的全过程。
01
冷冻电镜技术：“冷门”到“渐热”
即使对于我们最聪明的《大众科学》读者来说，冷冻电镜（cryo-electron microscopy, 简称 cryo-EM）可能也并不是一个耳熟能详的词汇。
作为一种结构生物学技术，冷冻电镜技术，顾名思义，就是应用冷冻固定术在低温下使用透射电子显微镜（Transmission Electron Microscope，简称 TEM）观察样品的显微技术。其解析结构的方法是通过用电子显微镜对冷冻固定在玻璃态的冰中的生物大分子进行成像，然后应用计算机对所摄取的生物大分子图像进行图像处理和计算，进而重构出生物大分子的三维结构。
打个通俗的比方，我们拿二维成像的照相机多方位、多角度地为一个苹果拍很多张照片，就能重构出苹果的三维模型。从这个角度来看，冷冻电镜就相当于一个照相机，当选好的冷冻样品被送到冷冻电镜后，拍照可得到很多二维图像，这些图像结合起来，便可以构建出一个冷冻样品的三维结构。
冷冻电镜操作步骤：
▲快速冷冻电镜样品（左上）；冷冻样品被放置在3毫米的autogrid上面（左下）；用镊子转移冷冻电镜样品（二排中间）；使用Titan Krios 300千伏冷冻电镜上样（右上）；冷冻电镜数据收集中（右下）
冷冻电镜概念 1970 年代被提出，技术发展也于同期开始。但由于分辨率远逊于结构生物学三大研究手段之一的 X射线晶体学技术（X-ray crystallography）【另一种是核磁共振技术（nuclear magnetic resonance，NMR）】，一直以来都不是结构生物学的主流研究方法，甚至在2013 年所谓“电镜革命”的浪潮来袭之前，它在专业领域都偏安一隅，属于一个小众研究领域。
1980 年代，全世界从事冷冻电镜相关研究的课题组不超过 20 个，总人数不超过 100 人；等到 2000 年初增至近 50 个；2010年左右，以冷冻电镜为主的研究团队已经超过 100 个。2013 年，在美国加州大学旧金山分校的旅美华人学者程亦凡与大卫•阿加德（David Agard）努力下，直接电子探测器（direct detection device，简称 DDD）被用于冷冻电镜单颗粒电镜图像记录，将生物大分子的结构解析到近原子分辨率级别，掀起一轮结构生物学的革命。
近年来，依靠冷冻电镜技术，越来越多的重要生物大分子复合物揭开了它们三维结构的“神秘面纱”，引发了全世界的大量关注。
02
催生众多重量级成果
相比国际，国内冷冻电镜技术起步稍晚，但是发展势头很猛。在这其中，清华大学扮演了十分重要的角色。
据雷建林介绍，在冷冻电镜研究领域，清华大学一直有深厚根基。1990 年代，清华大学生物科学与技术系教授隋森芳院士利用电子显微学和三维重构技术，结合生物物理学、生物化学和分子生物学等技术手段，探索研究蛋白质复合体的结构与功能，蛋白质在膜作用下结构与功能的变化等。
2007 年，“千人计划”专家施一公教授即将回国，当时国内冷冻电镜领域研究发展缓慢，也缺乏相关高端设备。在冷冻电镜技术成为主流之前，清华大学便提前布局，决定建设新的结构生物学实验设备。2008 年年中，施一公教授联合隋森芳教授，在即将回国的雷建林等人协助下，率先购置了亚洲第一台 Titan Krios 冷冻电镜（2009年 3 月 9 日到货）。
2000 多万人民币，这仅仅是 1 台 Titan Krios 冷冻电子显微镜的价格，整套仪器还需要电子探测器以及一些可选附件如相位板、能量过滤器等。但其在开展单颗粒三维重构、电子断层成像及电子晶体学等三维结构的研究方面有着突出的优势，能够解析蛋白复合物的结构以及亚细胞器甚至整个细胞的三维结构。
在国家蛋白质科学研究基础设施立项过程中，施一公院士联合王志新与隋森芳两位院士选定冷冻电镜作为清华大学分部的重点建设方向。2011 年，王宏伟教授放弃耶鲁大学的教职加入清华大学领衔冷冻电镜设备的购置工作。
“2012 年采购工作一经启动，我们马上预定了第二台Titan Krios，同时，我们在获悉了直接电子探测器开发进度的消息后，马上为第一台 Titan Krios 预订了一台 K2 相机。2013 年，我们又预订了第三台 Titan Krios。2013 年年底，加州大学旧金山分校程亦凡教授首次利用直接电子探测器 K2 相机和冷冻电镜技术解析了 TRPV1 膜蛋白 3.4 埃近原子分辨率结构。之后不久我们预订的 K2 相机到货了，于 2014 年 4 月份在第一台 Titan Krios 上安装完成并投入使用，立刻发生了立竿见影的作用。”
雷建林表示，依托 DDD 相机技术突破后的冷冻电镜技术，2015 年，清华大学以第一作者身份就在国际顶尖杂志 CNS（即《Cell》《Nature》《Science》三大学术期刊）发表了 6 篇论文。
▲清华大学冷冻电镜平台总管雷建林
作为目前中国国内冷冻电镜水平最高的研究机构，包括电镜应用和方法本身，清华大学冷冻电镜平台在电镜应用方面的论文产出，已经不亚于任何世界最顶级的同类机构。身为结构生物学的“利器”，截至 2017 年 11 月份，借助“冷冻电镜 + 结构生物学”的模式，清华大学冷冻电镜平台已诞生了30 篇 CNS，11月17日，施一公教授研究组在《细胞》（Cell）杂志上就《酿酒酵母“催化后剪接体”的结构》发表最新成果。这篇论文报道了酿酒酵母剪接体呈现RNA剪接反应完成后状态（定义为“P复合物”）、整体分辨率为3.6埃的三维结构，首次展示了pre-mRNA中3’剪接位点的识别状态。另外几项重要工作也分别获得了近几年的年度十大科技进展。
❶ 剪接体组装过程的关键
复合物U4/U6.U5 trisnRNP：A：冷冻电镜原始照片；B：二维分类；C：FSC分辨率曲线；D：重构出的三维结构。出处：Ruixue Wan et al.,Science 2016; 351:466-475.
❷ 酵母剪接体3.6埃分辨率的结构（Structure of ayeast spliceosome at 3.6 resolution.）出处：Chuangye Yanet al. Science 2015;349:1182-1191
❸RyR2闭合状态的冷冻电镜结构 (The cryo-EMstructure of RyR2 fromporcine heart (pRyR2) in a closed state.) 出处：Wei Peng etal. Science 2016;354:aah5324
2015 年，施一公教授团队在国际顶尖期刊《Science》上发表论文报告了酵母剪接体 3.6 埃分辨率的结构和前体信使 RNA 剪接的分子机制（如图❷所示），这是自1977 年发现 RNA 剪接以来，该领域在近 40 年的时间里最重要的一次突破：科学家第一次在近原子水平上看到了剪接体的细节，该项工作获得 2015 年度中国十大科技进展，随后该团队连续报道了更多状态的剪接体的结构，施一公教授也因剪接体结构解析的贡献获得未来科学大奖；清华大学杨茂君教授研究组在《Nature》和《Cell》杂志上连续报道了迄今为止分辨率最高的线粒体呼吸链超级复合物—呼吸体的冷冻电镜三维结构，入选 2016年中国生命科学领域十大进展；清华大学颜宁教授研究组与加拿大卡尔加里大学（University of Calgary）陈穗荣研究组合作在《Science》期刊报道了 RyR2 处于关闭和开放两种不同状态的近原子分辨率冷冻电镜结构（如图❸所示）。RyR2 蛋白样品纯化自猪心，样品的获取非常不易，得益于近年来清华大学冷冻电镜平台的迅猛发展，最终仅利用少量蛋白样品即解析了两个状态下的结构，该工作入选了 2016 年中国高等学校十大科技进展。
03
冷冻电镜的中国布局
雷建林介绍，平台目前共有 8 台透射电镜， 包含 3 台Titan Krios 冷冻电镜，还有双束显微镜、关联显微镜及和全套相关的辅助设备等。他表示就 Titan Krios 冷冻电镜来说，“太多课题项目都在争相申请，光是校内的需求都已经不太够用”。清华大学为此成立了专门的委员会来评审申请的课题，经过审议决定后，再为申请的课题组分配电镜的使用时间。从开始申请，至少需要一两个月后才能用上电镜。
“目前我们下一步的研究方向继续放在技术的应用上，除了蛋白质大分子的结构解析，新成立的结构生物学高精尖创新中心的一个重点是方法学的开发，另外一个重点还会放在电子断层术和细胞结构解析上。”雷建林表示：“我们认为依托冷冻电镜技术，电子断层术和细胞结构解析肯定是未来一个大的发展方向。今年的诺贝尔化学奖已经是电子显微镜领域的第三次得奖了，得奖主要还是因为单颗粒的方法得到了广泛应用。目前我们还很难解析细胞原位的高分辨率结构，通常只能通过生化手段把蛋白质提取出来再解析近原子分辨率的结构。随着冷冻电镜技术的再发展和突破，以后的发展方向应该是直接做原位研究。虽然这个方向，从技术上来看实现还有非常大的困难，但如果将来有大的突破的话，也许新的技术本身会再诞生一个诺贝尔奖，不排除冷冻电镜技术的应用也会产生诺贝尔奖。”
根据清华大学冷冻电镜平台统计，到 2017 年年底，中国将共有各种型号的冷冻电镜近 50 台，其中最高端的冷冻电镜约14台（含已到货暂未完成安装的）。到2018年年底，高端冷冻电镜的数字将可能增至近 30 台。到明年年底，全世界的高端冷冻电镜数量可能逼近 200 台。
雷建林说，尽管冷冻电镜在其他国家也在快速发展，但是中国的增长速度远超过世界平均水平；并且，这一趋势预计会再持续 5-10 年。当前，在冷冻电镜的数量上，美国处于国际上的领军地位，中、英、德等国处于第二集团。中国国内目前除了清华大学，中科院生物物理所、北京大学、浙江大学、南方科技大学、上海蛋白质中心、复旦大学、上海科技大学、上海药物所、上海交通大学、四川大学、中国科技大学、中山大学、天津大学、山西高等创新研究院等多家高校与科研机构也都已经或计划引进高端冷冻电镜。
雷建林也表示，仅仅依靠数量的增加是远远不够的，如何有效地用好这些资源，充分发挥它们的作用而不致浪费是一个很严峻的课题。目前中国国内冷冻电镜人才的缺口非常大：“包括我们自己都想再招 3~4 个人，但目前仍然没有招到。这个领域可用的人才真不是特别多。
作者和来源信息：北京科技报 | 科学加客户端
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