“百拓&安捷伦杯”生物医药色谱分析技术全国公开挑战赛自启动至今已有三周时间，我们通过线上和线下进行了多平台、多维度地宣传，旨在让更多生物医药行业用户参与进来，分享色谱分析技术，一较高下！
在这段时间内，有许多用户分享了他们的期待。令我们印象深刻的是，有个药学生曾在留言中写到：
“身为药学生，能遇到这样的好机会来证明自己，真的很开心。虽然自己的色谱分析技术还需提升，但也想试试看，不去试试怎么知道自己差在哪里，如何提升自己呢？”
看到大家如此热切的期待，更加坚定了我们做好比赛服务工作的决心。截止到发稿时间，我们共计收到全国五大赛区 264 名选手的报名信息。
图 1. 报名人数统计
在决赛期间，参赛选手将有机会参观产业园区，参与企业座谈会和技术交流会等活动，一睹新技术新设备的风采。还在等什么？赶紧
本次色谱分析技术挑战赛共分为初赛和决赛两部分，初赛考核选手的色谱分析理论知识，而决赛注重实战，选手将亲自动手操作常规液相进行大比拼。
实际生物医药分析技术远不止常规液相法，需要更多先进的仪器和先进的技术。其中，离子交换色谱法和毛细管电泳法就是比较有难度的色谱分析方法。我们以电荷异质体分析为例，讨论这两种方法的难点以及安捷伦的解决方案，且看下文：
为什么要分析电荷异质体？
生物药物生产和纯化过程的翻译后修饰和降解，如糖基化、碳端赖氨酸丢失、脱酰胺化、二硫键错配、糖化和氧化等，几乎都会直接或间接地引起蛋白表面电荷变化，产生不同的电荷异质体。
电荷异质体会影响单克隆抗体药物的体外及体内活性、安全性、可行性和质量，在研发和生产过程中鉴定和监测电荷异质体，对于药物安全具有重要意义。在生物药物的研发阶段，一般采用离子交换法和毛细管电泳法分离电荷异质体，并进行定性表征。
离子交换色谱法
使用离子交换色谱法分析电荷异质体的用户常常抱怨：耗费大量时间和精力配置不同 pH、不同盐浓度缓冲液；酸性峰和碱性峰往往需要离线收集后再进行质谱定性。那是还没了解到安捷伦 Buffer Advisor + 2DLC 解决方案：
Buffer Advisor 软件快速摸索离子交换方法条件
图 2. 快速摸索离子交换方法条件的流程
仅需配置 4 种储备溶液即可开展方法开发：
根据 pH 范围选择合适缓冲对（图 2 左 1），软件内嵌 63 种缓冲对（标示 pKa），支持单缓冲对、复合缓冲对模式，涵盖宽 pH 范围
编辑所需的 pH 梯度表/盐梯度表（图 2 左 2），软件即可自动生成缓冲对、盐储备液浓度（图 2 左 3），软件自动生成所需 pH 和离子强度的梯度表（图 2 左 4）
按照软件推荐的母液配方配制流动相（上图右）
2DLC 在线脱盐定性
对于离子交换色谱分离的多个酸性峰、碱性峰，在流出紫外检测器后，通过二维阀切换接口，被收集至多个 loop 环中，再被依次送入第二维液相，反相除盐后通过高分辨质谱检测。
图 3. 利妥昔原研药一维液相谱图和二维质谱图
毛细管电泳法
毛细管等电聚焦（CIEF）是电荷异质体表征的主要手段，但采用 CIEF 分离时收集馏分用于鉴定非常困难，所以 CIEF 通常用于监测电荷异质体而不能用于表征。质谱（MS）虽然广泛应用于单克隆抗体的表征，但是将 CIEF 和 MS 联机一直是非常大的挑战。质谱在线检测的缺失也限制了 CIEF 在蛋白电荷异质性的表征上的应用。
将 CIEF 分离的高分辨特性和质谱的表征能力结合起来是电荷异质体表征迫切需要的技术，基于安捷伦 7100 毛细管电泳的商品化接口（CMP）可以提供稳定、高灵敏度的分析结果。
图 4. 安捷伦 CE-MS 配置图
将 CIEF 分离的高分辨特性和质谱的表征能力结合起来是电荷异质体表征迫切需要的技术。基于安捷伦 7100 毛细管电泳（CE）的商品化接口（CMP）可以提供稳定、高灵敏度的分析结果。
图 5. 贝伐珠单抗 CIEF-MS 分析结果图
应用实例：贝伐珠单抗的分析
CIEF-MS 和 iCIEF-UV 分析得到的酸碱峰比例接近，分别为酸性峰: 主峰: 碱性峰= 23% :72%:5% 和 27%:68%:5%。除了 CE 的高分离度之外，质谱数据优异的原始谱图是实验分析制胜的关键，尤其是在鉴定跟主峰质量差别很小的变异体时，如在分析一个脱酰胺 (+1Da) 质量差时，一款性能优异的质谱是 CIEF-MS 分析的必备之选。
贝伐珠单抗的主峰分子量为149202 Da，碱性峰B1和主峰之间的质量差为 +128 Da，和碳端赖氨酸(+128 Da, +1K) 异质性匹配；碱性峰 B2 (∆=-17Da) 和氮端焦谷氨酸环化修饰 (-17Da) 匹配；酸性峰 A1 (∆= 1Da) 和脱酰胺修饰匹配。酸性峰 A1和主峰只有 1 Da 的质量差别，虽然我们会担心质谱准确度因素带来的不确定性，但酸性峰的位置和正好 1 Da 的质量差让我们有理由相信酸性峰 A1 是脱酰胺的修饰峰。A2 峰的信号非常弱，可能是高糖基化修饰的峰。
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